Mechanism of Xiaozheng Huoluo prescription in preventing liver fibrosis in rats via the ERK5 pathway: An analysis based on network pharmacology

肝细胞癌是全球癌症相关死亡的第三大常见原因，对于晚期肝癌患者，靶向治疗的效果仍不能满足临床需求^［1-5］，寻找新的基因靶点可进一步提升疗效及安全性，成为目前肝癌治疗领域的研究热点。减数分裂内切酶1（essential meiotic endonuclease 1，EME1）编码的蛋白质可与MUS81形成核酸内切酶复合物，作用于特定的DNA底物，包括Holiday连接、3′末端翘翼结构以及复制叉结构，在DNA链间交联、DNA双链断裂后修复过程中对重组中间产物的分解发挥着关键作用^［6］。既往研究^［7-9］发现，EME1高表达是膀胱癌、乳腺癌及肾透明细胞癌不良预后的高危因素，但其在肝癌中的表达和作用尚未见报道。本研究从TCGA数据库入手，通过生物信息学寻找肝癌组织中的高表达基因EME1，并在肝癌组织/癌旁组织中进行验证，通过基因沉默探讨EME1对肝癌细胞生物学行为的影响，以期鉴定新的治疗靶点。

1.   材料与方法

1.1   材料

人肝癌细胞BEL-7404/7402、Hep3B及人胚肾细胞293T均为本单位感染病研究所保存。慢病毒载体购自上海吉凯基因公司。鼠源EME1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，HRP标记山羊抗小鼠的二抗检测试剂盒购自北京中杉金桥公司。HiScript Ⅲ All-in one RT、SuperMix Perfect for qPCR逆转录试剂和Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞公司。RPMI 1640和MEM培养基购自美国Corning公司，胎牛血清（FBS）购自美国Geniala公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）购自北京鼎国昌盛公司，Caspase-Glo^® 3/7 Assay试剂盒购自美国Promega公司，碘化丙啶（PI）购自吉至生化公司。

1.2   TCGA数据库分析

下载TCGA数据库中肝细胞癌样本的mRNA seq表达谱，利用R软件中的“edge”包筛选癌及癌旁组织中高表达基因。

1.3   细胞培养

BEL-7404/7402细胞在含10%FBS的RPMI 1640细胞培养液、Hep3B细胞在含10%FBS的MEM细胞培养液中37 ℃、5% CO₂条件下培养。细胞传代使用0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3比例传代。

1.4   免疫组化染色

石蜡切片经脱蜡、水化、抗原修复后，FBS封闭后加入EME1一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗37 ℃孵育20 min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，镜检评分。染色结果进行半定量分析，以染色强度评分［阴性为0分，淡黄色（弱阳性）为1分，棕黄色（阳性）为2分，棕褐色（强阳性）为3分］和阳性细胞范围评分［≤25%为1分，26%～50%计为2分，51%～75%为3分，>75%为4分］乘积作为最终结果。

1.5   EME1沉默慢病毒载体的构建

EME1 短发夹RNA（shRNA）干扰序列为CTGAGAAGACAGGAAAGAA，两端分别添加AgeI（A^CCGGT）和EcoRI（G^AATTC）酶切位点黏性末端，并在正链3′端添加终止信号（TTTTT），反链5′端添加终止信号互补序列（AAAAA），合成DNA Oligo。双酶切hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒载体使其线性化，将DNA Oligo与载体质粒相连后转化感受态细胞，之后PCR扩增及测序鉴定（表1）。提取鉴定正确的质粒，利用第二代慢病毒包装系统，穿梭质粒GV115、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞，转染后48 h进行病毒收获，浓缩与纯化慢病毒。

表  1  EME1 shRNA引物序列

Table  1.  Sequences of essential meiotic structure-specific endonuclease 1 shRNA

名称	序列（5′-3′）
shRNA	正义链：CCGGCCCTGAGAAGACAGGAAAGAAC TCGAGTTCTTTCCTGTCTTCTCAGGGTTTTTG
	反义链：AATTCAAAAACCCTGAGAAGACAGGAAAG AACTCGAGTTCTTTCCTGTCTTCTCAGGG
shRNA-NC	正义链：CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCA AGAGAAGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG 反义链：AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCAC GTTCTCTT GAAACGTGACACGTTCGGAGAA
鉴定引物	正义链：CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA
	反义链：GTAATACGGTTATCCACG

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1.6   EME1沉默慢病毒感染BEL-7404细胞

对数生长期的BEL-7404细胞接种于6孔板（2×10⁵个/孔），培养至铺板量达30%后分别加入shRNA干扰表达慢病毒和阴性对照慢病毒，感染12 h后更换完全培养基继续培养。感染72 h后，荧光显微镜观察细胞感染效率。以GADPH为内参照，进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测（表2），2^-△△Ct法计算EME1相对表达量。

表  2  各基因引物序列

Table  2.  primer sequences

名称	序列（5′-3′）
EME1	正义链： TGACTTCAACAGCGACACCCA
	反义链： CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA
GAPDH	正义链： TCTGAGGAGTTGCCAACATTTG
	反义链： GGCTTCACAATCTGAGATGTCAA

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1.7   Western Blot检测

制备样品，每孔上样量为30 μg，10%的SDS-PAGE电泳分离，并转移到PVDF膜上，室温封闭1 h，一抗（1∶800）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜。二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST洗膜。化学发光法（ECL法）检测条带，以GAPDH为内参照，用Image J软件进行灰度值分析。

1.8   Celigo与MTT检测

对数生长期细胞接种于96孔板（2×10³个/孔），每天用Celigo检测读板。另设置一组进行MTT检测，培养终止前4 h加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，继续培养4 h后吸取培养液，每孔加入100 μL二甲基亚砜，振荡器振荡2 min，检测490 nm处的吸光值。

1.9   细胞克隆形成能力检测

对数生长期细胞接种于6孔板（800个/孔），持续培养10 d后使用4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗涤后加入500 μL/孔吉姆萨染液（10 min），ddH₂O洗涤细胞，晾干后拍照并克隆计数。

1.10   Caspase3/7检测

对数生长期细胞接种于96孔板（1×10⁴个/孔），Caspase-Glo3/7缓冲液10 mL溶解Caspase-Glo3/7冻干粉，每孔加入Caspase-Glo反应液100 μL，500 r/min离心30 min，室温孵育2 h后使用酶标仪测定信号强度。

1.11   PI-FACS-周期检测

收集处于对数生长期的细胞，用4 ℃预冷的D-Hanks洗涤细胞并沉淀，用4 ℃预冷的75%乙醇固定细胞1 h。1 300 r/min离心5 min，去固定液，用4 ℃预冷的D-Hanks洗涤细胞沉淀1次。加入1 mL的细胞染色液重悬，上机检测。

1.12   统计学方法

采用R语言软件4.2.1进行统计分析，每个实验均设置3个复孔，数据以x¯±s表示，两组间比较采用成组t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   人肝癌细胞中EME1 mRNA表达水平

TCGA数据库筛选出50对肝癌样本，EME1 mRNA在肝癌组织（114.5±153.0）的表达量是癌旁组织（8.0±7.2）的18.9倍（t=5.00，P<0.001）（图1a）。RT-qPCR结果显示，人肝癌细胞BEL-7404/7402和Hep3B中EME1 mRNA相对表达量（ΔCT值）分别为9.25、10.32和10.89，均<12，为高丰度表达（图1b）。

注： a，TCGA数据库分析EME1 mRNA表达水平；b，BEL-7404/7402、Hep3B细胞的EME1 mRNA表达水平。

图  1  EME1 mRNA在肝癌/癌旁组织中的表达情况

Figure  1.  Expression level of EME1 mRNA in HCC/paracancerous tissues

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2.2   人肝癌细胞中EME1的蛋白表达水平

选取病理确诊的3例肝癌患者的手术切除癌/癌旁组织进行Western Blot分析，结果显示肝癌组织EME1蛋白水平（249.0%± 35.5%）是癌旁组织（100.0%±77.8%）的2.5倍（t=3.02，P<0.05）（图2a、b）。选取病理确诊的5例肝癌患者的手术切除肝癌组织/癌旁组织进行免疫组化分析，结果显示肝癌组织EME1蛋白水平（8.4±2.6）是癌旁组织（1.2±0.4）的7.0倍（t=7.55，P<0.001）（图2c、d）。

注： a，Western Blot结果；b，Western Blot的定量分析；c，免疫组化结果（×200）；d，免疫组化的半定量分析。

图  2  EME1在肝癌/癌旁组织中的表达情况

Figure  2.  Expression level of EME1 in HCC/paracancerous tissues

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2.3   EME1稳定沉默BEL-7404细胞系的构建

荧光倒置相差显微镜观察慢病毒感染72 h后的BEL-7404细胞，结果显示感染效率达到80%以上，细胞状态正常（图3）。RT-qPCR结果显示，沉默组（shEME1）EME1 mRNA表达水平（29.9%±0.9%）相较于阴性对照组（shCtrl）（100.0%± 3.6%）显著降低（t=32.82，P<0.001）（图4a）；Western Blot结果显示，shEME1组EME1蛋白表达水平（35.7%±14.9%）相较于shCtrl组（100.0%±28.9%）显著降低（t=3.42，P<0.05）（图4b），表明EME1稳定沉默的肝癌细胞株BEL-7404构建成功。

图  3  慢病毒感染BEL-7404细胞48 h后荧光显微镜结果（×100）

Figure  3.  Fluorescence microscopie observation of BEL-7404 after transfection for 48 hours （×100）

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注： a，RT-qPCR检测不同处理组EME1 mRNA表达水平；b，Western Blot检测不同处理组EME1蛋白表达水平。

图  4  BEL-7404细胞的EME1沉默效率

Figure  4.  EME1 silencing efficiency in BEL-7404 cells

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2.4   EME1沉默后BEL-7404细胞增殖能力的变化

Celigo观察培养1～5天的BEL-7404细胞，结果显示随着培养时间的延长，相对于对照组，沉默组细胞数量显著下降，培养5天时沉默组为4 053±167，对照组为8 988±477，细胞数量下降了45.1%（t=16.91，P<0.001）（图5a、b）。MTT检测培养1～5天的BEL-7404细胞在490 nm处的吸光值，相对于对照组，沉默组细胞吸光值显著下降，培养5天时沉默组为0.518±0.046，对照组为0.774±0.022，细胞活性下降了66.9%（t=8.74，P<0.001）（5c）。培养10天后，沉默组克隆数（75±6）较对照组（260±9）显著减少，细胞克隆形成能力下降了29.0%（t=28.92，P<0.001）（图5d、e）。表明沉默EME1降低BEL-7404细胞的增殖能力。

注： a，Celigo计数仪在荧光视野下对BEL-7404细胞的单视野成像；b，Celigo计数仪计数单孔BEL-7404细胞的数量；c，MTT法检测BEL-7404细胞的增殖情况；d、e，BEL-7404细胞的克隆形成情况与克隆计数。

图  5  不同处理组BEL-7404细胞的增殖情况

Figure  5.  Proliferation of BEL-7404 cells in different treatment groups

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2.5   EME1沉默后BEL-7404细胞周期变化

流式细胞术检测慢病毒感染5天后的BEL-7404细胞周期，沉默组的G1期细胞比例显著高于对照组（49.9%±0.8% vs 44.0%±0.9%，t=8.96，P<0.001），G2/M期细胞比例显著低于对照组（15.9%±0.2% vs 17.9%±0.7%，t=9.13，P<0.001），S期细胞比例显著低于对照组（34.2%±0.6% vs 38.1%±0.5%，t=6.91，P<0.001）（图6）。

图  6  不同处理组BEL-7404细胞周期情况

Figure  6.  Cell cycle of BEL-7404 cells in different treatment groups

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2.6   EME1沉默后的BEL-7404细胞凋亡的变化

Caspase3/7活性分析显示感染shRNA慢病毒5天后，沉默组细胞的Caspase3/7活性（145.8%±5.9%）较对照组组（100.0%± 2.3%）显著升高1.5倍（t=12.50，P<0.001）（图7）。

图  7  不同处理组BEL-7404细胞的Caspase3/7活性

Figure  7.  Caspase3/7 activity of BEL-7404 cells in the negative control group and the experimental group

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3.   讨论

EME1对于哺乳动物细胞中 DNA 代谢的各个方面都很重要，Guo等^［10］研究发现EME1与胃癌细胞AGS和MGC-803的增殖及侵袭能力密切相关，沉默EME1基因表达可通过抑制蛋白激酶B活化，降低糖原合酶激酶-3β、细胞周期蛋白D1，从而抑制癌细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡。基于中国广西人群的研究^［11］发现EME1的Glu69Asp错义多态性与肝癌风险增加显著相关。EME1的另一外显子Ile350Thr变异会提高乳腺癌的易感性^［12］。

本研究发现沉默EME1的表达可降低肝癌的增殖能力。正常细胞中同源重组（homologous recombination，HR）相关蛋白受到高度的调控，对DNA序列具有相当高的特异性，一旦失调就会导致基因组的不稳定性。MUS81/EME1在异常的时间节点被激活，可能会导致细胞周期的阻滞、DNA向子细胞的不对称分布以及非整倍体。相反，过早的磷酸化会刺激Holiday连接交叉。HR途径的过表达可能引起DNA重排，导致癌基因活化或者抑癌基因的杂合性的缺失^［13］。HR介导基因表型的持续变化为肿瘤细胞提供生长优势，恶性表型的不断发展以及耐药性的产生。有研究^［14］发现，多发性骨髓瘤细胞和患者样本中的HR酶活性升高密切相关，抑制HR活性可显著减少新基因表型的产生，上调HR活性会增加基因突变的数量。持续获得HR介导的新基因，可能会导致癌基因的激活，促进肿瘤或耐药表型的获得。笔者推测高表达水平的EME1蛋白可能通过催化DNA-RNA杂交的形成导致基因组不稳定，或通过促成同源性驱动的易出错过程（如单链退火、复制模板切换和非等位HR）来促进突变。

结果表明，沉默EME1表达后Caspase3/7活性显著增高，有效促进细胞凋亡。细胞凋亡主要由Caspase家族蛋白酶执行，Caspase3/7负责对特定的细胞底物进行关键的切割，导致最终的凋亡细胞死亡。癌前病变的DNA损伤可通过诱导细胞凋亡来清除潜在的有害细胞从而阻断肿瘤生长。这一死亡过程的失控与异常的细胞增殖、肿瘤的发生和进展有关，细胞凋亡的失调被认为是癌症的标志之一^［15］。本研究同时发现沉默EME1表达后G1期细胞比例高于shCtrl组，表明抑制EME1表达能有效阻滞细胞周期，抑制肿瘤细胞生长。EME1虽然在G2/M期活性受到严格的调控，但其在细胞全周期中都能检测到。有研究^［16］证明有丝分裂中Cdk1活性的失调，会过早激活MUS81/EME1的有丝分裂同源重组，可能会诱导DNA损伤应答缺陷相关的细胞周期改变。蛋白激酶2（CK2）通过磷酸化调控MUS81/EME1复合物的活性，从而在有丝分裂和DNA复制应激后发挥不同的功能。在细胞有丝分裂过程中，CK2通过磷酸化MUS81/EME1增强其活性，有助于维持基因组的稳定性。但在细胞受到DNA复制应激后，CK2过度活化MUS81/EME1复合物会导致DNA损伤和染色体不稳定性^［17］。事实上，已经在许多肿瘤中发现CK2过表达^［18-19］，因此可以推测CK2可通过提高MUS81/EME1的生物学功能，促进人类基因组的不稳定性，还需要进一步研究确定肝癌中CK2的表达水平与MUS81/EME1的关系。在检查点激酶缺陷1的细胞中，由于核苷酸的缺乏不足以维持有丝分裂期DNA合成，MUS81/EME1复合物切割有丝分裂期间合成的新生DNA^［20］。这种机制并不会导致细胞的死亡，而是造成子细胞遗传了受损的DNA，MUS81/EME1复合物对晚期复制产物的异常处理会导致基因组不稳定。在FIBP敲低的肺腺癌中，EME1的过表达逆转了其对肺腺癌细胞增殖的抑制作用^［21］。该研究结果显示，EME1的过表达显著减少了γ-H2AX病灶形成，表明EME1参与肺腺癌细胞增殖和放射耐药性。FIBP与STAT3互作通过增强其磷酸化从而提高转录活性，并诱导靶基因EME1的表达。外源性STAT3的过表达也提高了FIBP缺陷肺腺癌细胞中的EME1表达水平，这一结果在另一项研究^［22］中也得到证实。此外，肿瘤细胞中的某些特异性的细胞因子常通过结合EME1的启动子上调其表达。

综上，EME1在肝癌组织中高表达，并在细胞功能学层面证明了沉默EME1基因可抑制肝癌细胞的增殖，阻滞细胞周期，诱导肝癌细胞的凋亡，为临床治疗提供了新思路。此外本研究对EME1在肝癌中发生发展限于细胞的功能性实验，后续还需对动物模型和分子机制进行下一步的探索。