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黄芪汤含药血清对血管内皮生长因子诱导的大鼠肝窦内皮细胞增殖、迁移和成管能力的影响及其作用机制
DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.10.015
Effect of serum containing Huangqi decoction on the proliferation, migration, and tubulogenesis of rat liver sinusoidal endothelial cells induced by vascular endothelial growth factor and its mechanism of action
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摘要:
目的 基于蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路探讨黄芪汤含药血清对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的大鼠肝窦内皮细胞(LSEC)增殖、迁移和成管能力的影响。 方法 制备黄芪汤含药血清，体外分离、培养SD大鼠LSEC，将大鼠LSEC随机分为空白组，VEGF组，血清对照组，低、中、高剂量黄芪汤含药血清组，利用噻唑蓝(MTT)比色法、Transwell实验、成管实验分别检测各组LSEC增殖、迁移和成管能力，通过Western Blot法检测血小板-内皮细胞黏附分子-1(CD31)、内皮素-1(ET-1)、内皮性一氧化氮合酶(eNOS) 和AKT/mTOR信号通路中AKT、磷酸化(p)-AKT、mTOR、磷酸化(p)-mTOR蛋白表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey’s检验。 结果 与空白组相比，VEGF组、血清对照组能够促进大鼠LSEC增殖、迁移和血管新生(P值均＜0.05)；Western Blot结果显示，CD31、ET-1、eNOS和AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达显著升高(P值均＜0.05)。VEGF组与血清对照组比较，上述指标差异均无统计学意义(P值均＞0.05)。与血清组比较，黄芪汤中、高剂量组能显著抑制VEGF诱导的大鼠LSEC增殖、迁移和血管新生(P值均＜0.05)；Western Blot结果显示，CD31、ET-1、eNOS和AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达均显著降低(P值均＜0.05)。 结论 较高剂量黄芪汤含药血清能抑制VEGF诱导的大鼠LSEC增殖、迁移和成管能力，其作用机制可能与调控AKT/mTOR信号通路有关。 -
关键词:
- 肝硬化 /
- 黄芪 /
- 肝窦内皮细胞 /
- 大鼠, Sprague-Dawley
Abstract:Objective To investigate the effect of serum containing Huangqi decoction on the proliferation, migration, and tubulogenesis of rat liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) induced by vascular endothelial growth factor (VEGF) and its mechanism of action based on the protein kinase B (AKT)/mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway. Methods The serum containing Huangqi decoction was prepared, and rat LSECs were isolated and cultured in vitro. Then rat LSECs were randomly divided into blank group, VEGF group, serum control group, and low-, middle-, and high-dose serum containing Huangqi decoction groups. MTT colorimetry, Transwell assay, and tubulogenesis assay were used to measure the proliferation, migration, and tubulogenesis abilities of LSECs in each group, and Western Blot was used to measure the protein expression levels of platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31), endothelin-1 (ET-1), and endothelial nitric oxide synthase (eNOS), as well as AKT, phosphorylated-AKT (p-AKT), mTOR, and phosphorylated mTOR (p-mTOR) in the AKT/mTOR signaling pathway. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the Tukey's test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the blank group, the VEGF group and the serum control group had significantly promoted proliferation, migration, and angiogenesis of rat LSECs (all P < 0.05), and Western Blot showed significant increases in the expression levels of CD31, ET-1, eNOS, and AKT/mTOR signaling pathway-related proteins (all P < 0.05). There were no significant differences in the above indices between the VEGF group and the serum control group (all P > 0.05). Compared with the serum group, the middle- and high-dose serum containing Huangqi decoction groups had significantly inhibited proliferation, migration, and angiogenesis of rat LSECs induced by VEGF (all P < 0.05), and Western Blot showed significant reductions in the expression levels of CD31, ET-1, eNOS, and AKT/mTOR signaling pathway-related proteins (all P < 0.01). Conclusion A relatively high dose of serum containing Huangqi decoction can significantly inhibit the proliferation, migration, and tubulogenesis of rat LSECs induced by VEGF, possibly by regulating the AKT/mTOR signaling pathway. -
肝纤维化是肝脏对多种病理刺激的自我修复反应。在该过程中，血管内皮生长因子(VEGF)表达上调，多种细胞因子激活肝星状细胞，使细胞外基质生成降解失衡、过度沉积。目前多数学者认为肝窦内皮细胞(LSEC)先于肝星状细胞激活，其持续去窗孔化、表型改变、形成内皮下基底膜，即肝窦毛细血管化，是肝纤维化、肝硬化的早期特征性病变[1-2]，由此伴随的内皮功能障碍和血管新生，会进一步加重肝纤维化的进展，并参与门静脉高压形成[3-4]。因此，如何抑制LSEC的增殖和血管新生对于肝纤维化、肝硬化的治疗具有重要意义[5]。
在肝硬化“虚损生积”理论的指导下[6]，本课题组前期临床研究[7]发现，黄芪汤可以改善乙型肝炎肝硬化伴轻、中度食管静脉曲张患者门静脉直径和食管静脉曲张Palmer评分。动物实验[8]成功复制胆管结扎大鼠肝硬化门静脉高压模型，发现黄芪汤可以显著降低门静脉压力，减少肝窦毛细血管化标志物的表达。基于此，本研究体外分离、培养大鼠LESC，进一步观察黄芪汤对LESC增殖、迁移和成管能力的影响并初步探讨其相关机制。
1. 材料与方法
1.1 动物
20只雄性SD大鼠，8周龄，体质量180~220 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005；实验动物使用许可证号：XYXK(沪)2020-0009。所有大鼠均饲养于上海中医药大学动物实验中心清洁级饲养室，饲养环境：22 ℃，12 h昼夜循环，自由进食饮水。适应性喂养3 d后进行实验。
1.2 细胞
分离的雄性SD大鼠原代LSEC。
1.3 药品
黄芪汤由黄芪30 g和炙甘草5 g组成，委托江苏江阴天江药业有限公司制作颗粒剂(批号：1212353)，1.2 g黄芪汤颗粒相当于黄芪生药量6 g、炙甘草生药量1 g。制备工艺如下：取饮片，加水煎煮二次，合并煎液，过滤。浓缩至一定相对密度的清膏，喷雾干燥，过筛。按照处方取以上提取物，混合30 min使之均匀。将以上混合物干法制粒，制成12~40目颗粒。采用空白铝箔袋喷印包装喷码，按照规格将颗粒包装成铝箔小袋。使用前配置成0.14 g/mL溶液(成人用量为6 g/d，体质量按60 kg计算，大鼠灌胃剂量等效约为人体14倍，因此换算为大鼠每天灌胃剂量1.4 g/kg)。
1.4 试剂与仪器
DMEM培养液、胎牛血清(FBS)、青链霉素混合液、RIPA裂解液购于北京索莱宝科技公司，货号分别为：11995、S9030、P1400、R0010；BCA蛋白检测试剂盒、噻唑蓝(MTT)试剂盒、ECL化学发光试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，货号分别为：P0012、C0009S、P0018M；重组鼠细胞VEGF购于美国PeproTech公司，货号：400-31；Matrigel基质胶购于美国Corning公司，货号：356234；GAPDH抗体、血小板-内皮细胞黏附分子-1(CD31)抗体、内皮性一氧化氮合酶(eNOS)抗体、蛋白激酶B(AKT)抗体、磷酸化(p)-AKT抗体、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗体、磷酸化(p)-mTOR抗体购于英国Abcam公司，货号分别为：ab9485、ab28364、ab5589、ab126811、ab8805、ab2732、ab63552；内皮素-1(ET-1)抗体购于南京安研生物科技有限公司，货号：NY-174490M；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购于英国Abcam公司，货号：ab97051。5415R型高速低温离心机(日本Olympus公司)；pectramax M5酶标仪(美国Molecular Devices公司)；DP80倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；041BR127719型电泳仪及转膜仪(美国Bio-Rad公司)。
1.5 方法
1.5.1 黄芪汤药物血清制备
随机选择SD大鼠10只，按照1.4 g/kg的剂量给予黄芪汤灌胃，另10只大鼠给予相同体积的蒸馏水灌胃。1次/d，连续3 d。第3天给药灌胃后2 h，无菌条件下腹主动脉取血10 mL，4 ℃静置2 h，离心制备血清(3000 r/min、20 min)，56 ℃灭活30 min，过滤，-80 ℃储存备用。此药物血清为高剂量组，1倍比稀释为中剂量含药血清，3倍比稀释为低剂量含药血清。
1.5.2 大鼠LSEC分离和培养
使用雄性SD大鼠用于分离原代LSEC，分离方法：将前灌流液、胶原酶溶液等置于37 ℃水浴预热，无菌硅胶管一端通过恒流泵与前灌流液瓶相连，另一端通过气泡管与穿刺针相连接。大鼠麻醉后，分别用碘酒、酒精消毒皮毛，U型剖腹术分层打开腹腔，暴露内脏。分离门静脉，在门静脉近肝门处围结扎线，门静脉穿刺，插入留置针，扎紧管口，开启恒流泵，流量为10~20 mL/min，迅速剪断下腔静脉，使肝脏变为均匀的淡黄色。分离肝脏，连同留置针悬挂于放有布氏漏斗的铁架台上，待前灌流液灌注约8 min后，开始灌注胶原酶溶液循环灌注20 min，待肝被膜下肝组织几乎液化后，快速剪下肝脏，转移至培养皿，剪碎后放入装有50 mL胶原酶溶液的硅化三角烧瓶中，加入4 mL DNA酶Ⅰ溶液，加酶配制液至100 mL。将烧瓶放入恒温水浴振荡器分散肝组织，200 r/min，37 ℃，20 min。振荡后将细胞悬液通过二层200目不锈钢筛滤至2根50 mL离心管中，将细胞悬液离心(900 r/min、5 min)，收集上清。然后将上清离心(1800 r/min、10 min)，收集沉淀；用PBS重悬沉淀后再次离心(1800 r/min、10 min)；再用10 mL PBS混匀沉淀，得到LSEC细胞悬液。沿离心管壁依次加入体积分数50%的percoll 15 mL，体积分数为25%的percoll 20 mL和10 mL细胞悬液，离心(2700 r/min、20 min)。小心吸取50%和25% percoll间的LSEC混浊带，加等量PBS，混匀，离心(2700 r/min、10 min)；将沉淀悬于10 mL 20% FBS DMEM培养基中，40 min后，收集未贴壁细胞悬液，再培养于另一培养瓶中，并进行细胞计数。LSEC采用含有10% FBS、1%双抗生素的DMEM培养液，置于37 ℃恒温、5% CO2培养箱中孵育。
1.5.3 LSEC分组和药物干预处理
LSEC分为6组：空白组，VEGF组，血清对照组，黄芪汤低、中、高剂量组(以下简称空白组、VEGF组、血清组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)，每组LSEC均采用含有10% FBS、1%双抗生素的DMEM培养液培养。实验中各组LSEC药物干预处理方法如下：(1)空白组，予以上述培养液；(2)VEGF组，予以40 ng/mL的VEGF；(3)血清组，予以VEGF和10%空白血清；(4)低剂量组，予以VEGF和10%低剂量黄芪汤含药血清；(5)中剂量组，予以VEGF和10%中剂量黄芪汤含药血清；(6)高剂量组，予以VEGF和10%高剂量黄芪汤含药血清。
1.5.4 MTT检测
各组LSEC以1×104个/孔的密度接种于96孔板，予以100 μL上述培养液，37 ℃、5% CO2环境下培养48 h，然后20 μL/孔加入5 mg/mL MTT溶液，37 ℃恒温孵育4 h，弃去每孔残液，150 μL/孔加入二甲基亚砜。将96孔板置于摇床轻微摇动10 min，酶标仪检测490 nm波长的吸光值，计算细胞活力，细胞活力(%)=处理组细胞吸光值/对照组细胞吸光值×100%。
1.5.5 Transwell实验
各组LSEC悬浮于无血清培养液，密度为1×106个/mL。在上室(8 μm孔径)6孔插板上种植500 μL LSEC悬浮液；在下室添加600 μL(10% FBS和1%双抗生素)DMEM培养液。于37 ℃和5% CO2环境下孵育24 h，将迁移细胞使用4%多聚甲醛固定15 min，然后使用0.1%结晶紫染色15 min，漂洗，显微镜下观察、计数。
1.5.6 成管实验
将Corning凝胶基底膜基质(150 μL，10 μg/mL)预包被于24孔板，将密度为1×105个/孔的LSEC种植于24孔板，依照分组加入相应的培养液，37 ℃、5% CO2培养12 h后，在显微镜下观察LSEC，应用Image J软件进行血管生成长度测量。血管长度(%)=处理组细胞管长/空白组细胞管长×100%。
1.5.7 Western Blot检测
各组LSEC培养48 h后收集，使用RIPA裂解液抽提总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒检测总蛋白含量，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜到PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下1 h进行阻断封闭，加入CD31(1∶ 1000)、eNOS(1∶ 1000)、ET-1(1∶ 1000)、AKT(1∶ 1000)、p-AKT(1∶ 500)、mTOR(1∶ 1000)、p-mTOR (1∶ 500)、GAPDH(1∶ 1000)一抗，4 ℃过夜。加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(1∶ 2000)室温下2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，用ECL发光液显影，采用Image J软件分析。
1.6 统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey’s检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 黄芪汤含药血清对VEGF诱导大鼠LSEC增殖的影响
MTT检测结果显示：与空白组相比，VEGF组、血清组、低剂量组LSEC增殖均显著增加(P值均＜0.05)；VEGF组、血清组、低剂量组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；与血清组比较，中、高剂量组的LSEC活性显著下降(P值均＜0.05)，其中高剂量组比中剂量组的细胞活力下降更为明显(P＜0.05)(表 1)。
表 1 各组大鼠LESC活力比较Table 1. Comparison of LESC cell activity in each group组别 细胞活力(%) 空白组 100.00±12.05 VEGF组 156.35±16.891) 血清组 165.22±18.521) 低剂量组 173.52±21.561) 中剂量组 131.21±15.672) 高剂量组 111.52±12.362)3) F值 7.317 P值 0.002 注：与空白组比较，1)P＜0.05；与血清组比较，2)P＜0.05；与中剂量组比较，3)P＜0.05。 2.2 黄芪汤含药血清对大鼠LSEC迁移的影响
Transwell试验结果显示：与空白组相比，VEGF组、血清组的LSEC迁移数目显著增多(P值均＜0.05)；血清组与VEGF组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)；与血清组比较，低剂量组细胞的迁移数目明显增加(P＜0.05)，而中、高剂量组细胞的迁移数目明显减少(P值均＜0.05)(图 1，表 2)。
图 1 不同剂量黄芪汤含药血清对大鼠LSEC迁移的影响(结晶紫染色，×100)注：a，空白组；b，VEGF组；c，血清组；d，低剂量组；e，中剂量组；f，高剂量组。Figure 1. Effects of different doses of serum containing Huangqi Decoction on LSEC migration (crystal violet staining, ×100)表 2 各组大鼠LESC迁移细胞数目比较Table 2. Comparison of LESC migration cell numbers in each group组别 迁移细胞数(个) 空白组 35.64±3.65 VEGF组 153.63±16.591) 血清组 155.24±15.221) 低剂量组 371.25±41.262) 中剂量组 85.64±10.372) 高剂量组 81.23±9.572) F值 83.199 P值 ＜0.001 注：与空白组比较，1)P＜0.05；与血清组比较，2)P＜0.05。 2.3 黄芪汤含药血清对大鼠LSEC成管能力的影响
成管实验结果显示：空白组LSEC几乎无管腔结构形成。与空白组相比，VEGF组、血清组能明显促进LSEC管腔结构形成，其成管节点数、交叉点数、血管长度均显著增加(P值均＜0.05)；血清组与VEGF组成管能力比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；与VEGF组、血清组相比，低剂量组对LSEC成管具有促进作用，可见管腔形成(P值均＜0.05)，而中、高剂量组在成管节点数、交叉点数、血管长度方面均显著降低，较少有完整管腔形成(P值均＜0.05)(图 2，表 3)。
图 2 不同剂量黄芪汤含药血清对大鼠LSEC成管能力的影响(×100)注：a，空白组；b，VEGF组；c，血清组；d，低剂量组；e，中剂量组；f，高剂量组。Figure 2. Effects of different doses of serum containing Huangqi Decoction on LSEC tubulogenesis abilities (×100)表 3 各组大鼠LESC成管能力比较Table 3. Comparison of LESC tubulogenesis abilities in each group组别 节点(个) 交叉点(个) 血管长度(%) 空白组 126.00±11.14 33.33±7.02 100.00±12.63 VEGF组 985.67±93.931) 266.00±26.851) 421.56±68.531) 血清组 922.34±71.011) 263.33±9.291) 475.63±59.671) 低剂量组 1537.67±84.332)3) 431.67±10.502)3) 864.55±124.352)3) 中剂量组 424.34±51.002)3)4) 115.67±9.612)3)4) 225.64±42.362)3)4) 高剂量组 205.34±49.002)3)4)5) 60.00±14.112)3)4)5) 185.66±25.672)3)4) F值 204.507 332.945 46.289 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与空白组比较，1)P＜0.05；与VEGF组比较，2)P＜0.05；与血清组比较，3)P＜0.05；与低剂量组比较，4)P＜0.05；与中剂量组比较，5)P＜0.05。 2.4 黄芪汤含药血清对大鼠LSEC表达CD31、eNOS和ET-1的影响
Western blot检测结果显示：与空白组比较，VEGF组、血清组LSEC中CD31、eNOS和ET-1蛋白表达显著升高(P值均＜0.05)；VEGF组与血清组蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)；与VEGF组、血清组比较，低剂量组CD31和eNOS蛋白表达差异不明显(P＞0.05)，ET-1蛋白表达显著升高(P＜0.05)；与VEGF组、血清组、低剂量组相比，中剂量组CD31、eNOS和ET-1蛋白表达水平均显著下降(P值均＜0.05)；与中剂量组比较，高剂量组CD31、eNOS和ET-1蛋白表达水平均显著降低(P值均＜0.05)(图 3，表 4)。
图 3 各组大鼠LSEC中CD31、eNOS、ET-1、GAPDH蛋白表达Figure 3. Expression of CD31, eNOS, ET-1 and GAPDH proteins in LSEC in each group表 4 各组大鼠LESC中CD31、eNOS、ET-1蛋白表达比较Table 4. Comparison of CD31, eNOS and ET-1 protein expression in LESC in each group组别 CD31 eNOS ET-1 空白组 0.201±0.025 0.053±0.006 0.048±0.005 VEGF组 1.385±0.1391) 0.465±0.0471) 1.052±0.1061) 血清组 1.362±0.1421) 0.452±0.0461) 1.163±0.1161) 低剂量组 1.353±0.136 0.461±0.048 1.583±0.2372)3) 中剂量组 0.575±0.0732)3)4) 0.227±0.0272)3)4) 0.685±0.0692)3)4) 高剂量组 0.067±0.0122)3)4)5) 0.153±0.0152)3)4)5) 0.206±0.0212)3)4)5) F值 89.514 56.273 60.760 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与空白组比较，1)P＜0.05；与VEGF组比较，2)P＜0.05；与血清组比较，3)P＜0.05；与低剂量组比较，4)P＜0.05；与中剂量组比较，5)P＜0.05。 2.5 黄芪汤含药血清对AKT/mTOR信号通路的影响
Western blot检测结果显示：与空白组比较，VEGF组、血清组、低剂量组LSEC中p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达均明显增加(P值均＜0.05)；VEGF组与血清组之间p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达的差异无统计学意义(P＞0.05)；与低剂量组和血清组相比，中剂量组LSEC的p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均明显下降(P值均＜0.05)；与中剂量组比较，高剂量组LSEC的p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平显著下降(P值均＜0.05)(图 4，表 5)。
图 4 各组大鼠LSEC中AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达Figure 4. Expression of AKT/mTOR signaling pathway related proteins in LSEC in each group表 5 各组大鼠LESC中AKT/mTOR信号通路蛋白表达比较Table 5. Comparison of AKT/mTOR signaling pathway protein expression in LESC in each group组别 p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR 空白组 0.257±0.025 0.852±0.027 VEGF组 0.865±0.1391) 1.229±0.0131) 血清组 0.834±0.1421) 1.227±0.0211) 低剂量组 1.425±0.1361)3) 1.197±0.0121)3) 中剂量组 0.268±0.0732)3)4) 1.065±0.0252)3)4) 高剂量组 0.054±0.0122)3)4)5) 0.696±0.0242)3)4)5) F值 52.884 337.037 P值 ＜0.001 ＜0.001 注：与空白组比较，1)P＜0.05；与VEGF组比较，2)P＜0.05；与血清组比较，3)P＜0.05；与低剂量组比较，4)P＜0.05；与中剂量组比较，5)P＜0.05。 3. 讨论
慢性肝病是全球面临的主要健康挑战之一，肝纤维化是慢性肝病进程中重要的病理阶段，决定了慢性肝病的发展和预后。如何控制、逆转肝纤维化成为慢性肝病治疗的关键。目前抗肝纤维化治疗尚未满足对预防慢性肝病进展为肝硬化、肝癌的需求[9-10]，在中医学整理观念和辨证论治原则指导下，探索、优化中医药抗肝纤维化的治疗方案，符合当前肝纤维化治疗的主流[11-12]。
肝纤维化是肝脏损伤的阶段性病理改变，现代医学未将其归属于一个独立性的疾病，中医古籍亦无肝纤维化的病名记载，现多将其归属于“胁痛”“肝积”等范畴，其病因各异，但基本病机可归纳为“虚损生积”，即机体功能损伤，无以化气，因虚致瘀，因虚生积[13]。治积之要，张元素认为“当先养正则积自除”，强调扶助正气的重要性。黄芪汤出自北宋《太平惠民和剂局方》，由黄芪、甘草6∶ 1相虚配伍，黄芪益气扶正，且能活血生血，甘草缓气养阴血，且助黄芪益气补血，与肝纤维化病机相契合，补气癥自消，养正积自除，虚瘀同治，标本兼顾。
LSEC是肝窦内数目最多的非实质细胞群，在维持肝脏稳态方面发挥重要的作用，其结构和功能的改变常常是肝纤维化发生的初始事件[14]。众所周知，病理性血管的新生，既伴发于肝纤维化的发生，又能加速肝纤维化的进程。肝窦毛细血管化是肝脏微血管生成的主要形式，其发生能进一步加重肝脏微循环障碍，促进肝纤维化、肝硬化的发展及并发症的形成，使肝纤维化逆转更加困难。因此抑制肝窦毛细血管化和LSEC介导的病理性血管新生，可能成为肝纤维化防治的重要策略。生理状态下LSEC不表达CD31，随着肝窦毛细血管化发生，LSEC表型发生变化，CD31表达增加，因此CD31被认为是肝窦毛细血管化的标志物[15]。ET-1主要来源于内皮细胞，与内皮素受体结合促进内皮细胞的增殖和迁移，是内皮功能障碍的病理生理学基础[16]。研究[17]表明LSEC功能障碍和损伤后会合成及分泌丰富的ET-1，引起LSEC窗孔结构改变、缩小，促进肝窦毛细血管化[18]。VEGF是eNOS的激活剂，慢性肝病中VEGF表达升高，促进LSEC表达eNOS，引起内皮细胞增殖和血管通透性改变[19]，有利于长期局部血管的生成[1, 20]。AKT是调控细胞增殖、分化和血管生成的重要信号分子，mTOR是其下游信号分子之一，AKT/mTOR信号通路的激活在细胞增殖、血管生成中发挥重要的作用[21]。
本研究以大鼠LSEC作为研究对象，以VEGF刺激LSEC来模拟肝纤维化发生时LSEC所处的病理环境，予以不同剂量的黄芪汤含药血清干预。结果显示，血清对照组中在VEGF诱导下可以促进LSEC增殖、迁移和血管新生，促进CD31、eNOS、ET-1蛋白表达和AKT/mTOR信号通路的激活，中、高剂量的黄芪汤含药血清可以抑制由VEGF诱导的LSEC增殖、迁移和血管新生，抑制CD31、eNOS、ET-1蛋白表达，该作用机制可能与抑制AKT/mTOR信号通路的激活相关。值得注意的是，黄芪汤对LSEC成管能力的影响可能与剂量相关，低剂量时可以促进血管新生，中、高剂量时可以抑制血管新生。关于黄芪汤对LSEC成管能力的影响更深层次的作用机制，本研究团队将在后续研究中进一步探索。
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注：a，空白组；b，VEGF组；c，血清组；d，低剂量组；e，中剂量组；f，高剂量组。
图 1 不同剂量黄芪汤含药血清对大鼠LSEC迁移的影响(结晶紫染色，×100)
Figure 1. Effects of different doses of serum containing Huangqi Decoction on LSEC migration (crystal violet staining, ×100)
注：a，空白组；b，VEGF组；c，血清组；d，低剂量组；e，中剂量组；f，高剂量组。
图 2 不同剂量黄芪汤含药血清对大鼠LSEC成管能力的影响(×100)
Figure 2. Effects of different doses of serum containing Huangqi Decoction on LSEC tubulogenesis abilities (×100)
图 3 各组大鼠LSEC中CD31、eNOS、ET-1、GAPDH蛋白表达
Figure 3. Expression of CD31, eNOS, ET-1 and GAPDH proteins in LSEC in each group
图 4 各组大鼠LSEC中AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达
Figure 4. Expression of AKT/mTOR signaling pathway related proteins in LSEC in each group
表 1 各组大鼠LESC活力比较
Table 1. Comparison of LESC cell activity in each group
组别 细胞活力(%) 空白组 100.00±12.05 VEGF组 156.35±16.891) 血清组 165.22±18.521) 低剂量组 173.52±21.561) 中剂量组 131.21±15.672) 高剂量组 111.52±12.362)3) F值 7.317 P值 0.002 注：与空白组比较，1)P＜0.05；与血清组比较，2)P＜0.05；与中剂量组比较，3)P＜0.05。 
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表 2 各组大鼠LESC迁移细胞数目比较
Table 2. Comparison of LESC migration cell numbers in each group
组别 迁移细胞数(个) 空白组 35.64±3.65 VEGF组 153.63±16.591) 血清组 155.24±15.221) 低剂量组 371.25±41.262) 中剂量组 85.64±10.372) 高剂量组 81.23±9.572) F值 83.199 P值 ＜0.001 注：与空白组比较，1)P＜0.05；与血清组比较，2)P＜0.05。
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表 3 各组大鼠LESC成管能力比较
Table 3. Comparison of LESC tubulogenesis abilities in each group
组别 节点(个) 交叉点(个) 血管长度(%) 空白组 126.00±11.14 33.33±7.02 100.00±12.63 VEGF组 985.67±93.931) 266.00±26.851) 421.56±68.531) 血清组 922.34±71.011) 263.33±9.291) 475.63±59.671) 低剂量组 1537.67±84.332)3) 431.67±10.502)3) 864.55±124.352)3) 中剂量组 424.34±51.002)3)4) 115.67±9.612)3)4) 225.64±42.362)3)4) 高剂量组 205.34±49.002)3)4)5) 60.00±14.112)3)4)5) 185.66±25.672)3)4) F值 204.507 332.945 46.289 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与空白组比较，1)P＜0.05；与VEGF组比较，2)P＜0.05；与血清组比较，3)P＜0.05；与低剂量组比较，4)P＜0.05；与中剂量组比较，5)P＜0.05。
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表 4 各组大鼠LESC中CD31、eNOS、ET-1蛋白表达比较
Table 4. Comparison of CD31, eNOS and ET-1 protein expression in LESC in each group
组别 CD31 eNOS ET-1 空白组 0.201±0.025 0.053±0.006 0.048±0.005 VEGF组 1.385±0.1391) 0.465±0.0471) 1.052±0.1061) 血清组 1.362±0.1421) 0.452±0.0461) 1.163±0.1161) 低剂量组 1.353±0.136 0.461±0.048 1.583±0.2372)3) 中剂量组 0.575±0.0732)3)4) 0.227±0.0272)3)4) 0.685±0.0692)3)4) 高剂量组 0.067±0.0122)3)4)5) 0.153±0.0152)3)4)5) 0.206±0.0212)3)4)5) F值 89.514 56.273 60.760 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与空白组比较，1)P＜0.05；与VEGF组比较，2)P＜0.05；与血清组比较，3)P＜0.05；与低剂量组比较，4)P＜0.05；与中剂量组比较，5)P＜0.05。
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表 5 各组大鼠LESC中AKT/mTOR信号通路蛋白表达比较
Table 5. Comparison of AKT/mTOR signaling pathway protein expression in LESC in each group
组别 p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR 空白组 0.257±0.025 0.852±0.027 VEGF组 0.865±0.1391) 1.229±0.0131) 血清组 0.834±0.1421) 1.227±0.0211) 低剂量组 1.425±0.1361)3) 1.197±0.0121)3) 中剂量组 0.268±0.0732)3)4) 1.065±0.0252)3)4) 高剂量组 0.054±0.0122)3)4)5) 0.696±0.0242)3)4)5) F值 52.884 337.037 P值 ＜0.001 ＜0.001 注：与空白组比较，1)P＜0.05；与VEGF组比较，2)P＜0.05；与血清组比较，3)P＜0.05；与低剂量组比较，4)P＜0.05；与中剂量组比较，5)P＜0.05。
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