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miR-21靶向调控PTEN/PI3K/Akt通路对胆管癌细胞恶性生物学行为的影响
DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.09.026
Effect of micro-ribonucleic acid-21 on the malignant biological behavior of cholangiocarcinoma cells by targeting the PTEN/PI3K/Akt pathway
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摘要:
目的 探讨微小核糖核酸-21(miR-21)靶向蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)/磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B (Akt)通路对人胆管癌细胞株QBC939恶性生物学行为的影响。 方法 将对数期生长的胆管癌细胞株QBC939分为4组: 空载组、空白对照组、过表达组、沉默组。倒置荧光显微镜检测转染效率; 四甲基偶氮唑蓝法、流式细胞仪、Transwell小室实验、划痕实验检测细胞增殖活性、凋亡率、侵袭活性和迁移活性。实时逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-21、PTEN、PI3K、Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) mRNA的表达; 免疫印迹法检测PTEN、PI3K、Akt、磷酸化Akt (p-Akt)和mTOR蛋白表达; 双荧光素酶报告基因实验验证miR-21对PTEN的作用。计量资料多组间比较采用单因素方差分析, 进一步两两差异比较采用SNK-q检验。 结果 过表达组、沉默组、空载组转染效率分别为(90.27±18.03)%、(91.43±18.26)%和(92.16±18.41)%。与空白对照组和空载组比较, 过表达组QBC939细胞增殖活性明显提高(P值均 < 0.05), 凋亡率显著下降(P值均 < 0.01);与空白对照组、空载组和过表达组比较, 沉默组细胞增殖活性显著降低(P值均 < 0.01), 而凋亡率显著上升(P值均 < 0.01)。与空白对照组和空载组比较, 过表达组QBC939细胞迁移率和穿膜数目均显著增高(P值均 < 0.01);与空白对照组、空载组和过表达组比较, 沉默组迁移率和穿膜数目均显著下降(P值均 < 0.01)。与空白对照组和空载组比较, 过表达组miR-21、PI3K、Akt和mTOR mRNA表达均升高, PTEN mRNA表达下降, 差异均有统计学意义(P值均 < 0.05);与空白对照组、空载组和过表达组比较, 沉默组miR-21、PI3K、Akt和mTOR mRNA表达均下降, PTEN mRNA表达升高, 差异均有统计学意义(P值均 < 0.05)。与空白对照组和空载组比较, 过表达组PI3K、Akt、p-Akt和mTOR蛋白表达均显著升高, PTEN蛋白表达显著下降(P值均 < 0.01);与空白对照组、空载组和过表达组比较, 沉默组PI3K、Akt、p-Akt和mTOR蛋白表达均显著下降, PTEN蛋白表达显著升高(P值均 < 0.01)。miR-21可靶向调控PTEN的表达。 结论 miR-21沉默可靶向PTEN/PI3K/Akt通路, 上调PTEN表达, 下调PI3K、Akt、mTOR表达及p-Akt水平, 抑制人胆管癌细胞株QBC939的恶性行为。 Abstract:Objective To investigate the effect of micro-ribonucleic acid-21(miR-21) on the malignant biological behavior of human cholangiocarcinoma cell line QBC939 by targeting the protein tyrosine phosphatase (PTEN)/inositol phosphate 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) pathway. Methods The cholangiocarcinoma cell line QBC939 in the logarithmic growth phase was divided into empty vector group, blank control group, overexpression group, and silencing group.An inverted fluorescence microscope was used to observe transfection efficiency; MTT assay, flow cytometry, Transwell assay, and wound healing assay were used to measure cell proliferative activity, apoptosis rate, invasion activity, and migration activity.Quantitative reverse transcription PCR was used to measure the mRNA expression levels of miR-21, PTEN, PI3K, Akt, and mammalian target of rapamycin (mTOR); Western blotting was used to measure the protein expression levels of PTEN, PI3K, Akt, phosphorylated Akt (p-Akt), and mTOR; dual-luciferase reporter assay was used to verify the effect of miR-21 on PTEN.A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the SNK-q test was used for further comparison between two groups. Results Transfection efficiency was 90.27%±18.03% in the overexpression group, 91.43%±18.26% in the silencing group, and 92.16%±18.41% in the empty vector group.Compared with the blank control group and the empty vector group, the overexpression group had a significant increase in the proliferative activity of QBC939 cells (both P < 0.05) and a significant reduction in apoptosis rate (both P < 0.01);compared with the blank control group, the empty vector group, and the overexpression group, the silencing group had a significant reduction in proliferative activity (P < 0.01) and a significant increase in apoptosis rate (P < 0.01).Compared with the blank control group and the empty vector group, the overexpression group had significant increases in the migration rate of QBC939 cells and number of cells penetrating the membrane (all P < 0.01);compared with the blank control group, the empty vector group, and the overexpression group, the silencing group had significant reductions in migration rate and number of cells penetrating the membrane (all P < 0.01).Compared with the blank control group and the empty vector group, the overexpression group had significant increases in the mRNA expression levels of miR-21, PI3K, Akt, and mTOR and a significant reduction in the mRNA expression level of PTEN (all P < 0.05);compared with the blank control group, the empty vector group, and the overexpression group, the silencing group had significant reductions in the mRNA expression levels of miR-21, PI3K, Akt, and mTOR and a significant increase in the mRNA expression level of PTEN (all P < 0.05).Compared with the blank control group and the empty vector group, the overexpression group had significant increases in the protein expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, and mTOR and a significant reduction in the protein expression level of PTEN (all P < 0.01);compared with the blank control group, the empty vector group, and the overexpression group, the silencing group had significant reductions in the protein expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, and mTOR and a significant increase in the protein expression level of PTEN (all P < 0.01).Furthermore, miR-21 showed targeted regulation of PTEN expression. Conclusion MiR-21 silencing may inhibit the malignant biological behavior of human cholangiocarcinoma cell line QBC939 by targeting the PTEN/PI3K/Akt signaling pathway to upregulate the expression of PTEN and downregulate the expression of PI3K, Akt, mTOR, and p-Akt. -
Key words:
- MicroRNAs /
- Signal Transduction /
- Cell Proliferation /
- Apoptosis
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胆管癌源是肝胆系统中高度致命的恶性肿瘤，近年来全球范围内发病率不断上升[1-2]。目前胆管癌病因尚不明确，手术切除是其主要的根治性手段。但由于胆管癌早期症状不明显且诊断困难，大多数患者初诊时已处于晚期，总体手术切除率极低[3]。此外，胆管癌具有高侵袭转移性，恶性进展迅速，导致总体预后差、病死率高，严重威胁人类健康[4]。因此探索新的胆管癌治疗方式具有重要意义。已知肿瘤的发生和发展是由多基因调控，其中原癌基因和抑癌基因的激活与失活发挥重要功能[5]。随着肿瘤细胞增殖凋亡研究深入，多数原癌基因、抑癌基因及其信号转导通路成为肿瘤靶向治疗的关键点[6]。蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)/磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路在恶性肿瘤细胞的增殖分化过程中起重要作用[7]。PTEN是目前公认的抑癌基因之一，研究[8]表明过表达PTEN可抑制PI3K/Akt信号通路并抑制胆管癌细胞迁移能力。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)可靶向调控基因转录后翻译或使其降解，研究[9-10]表明miRNA-21(miR-21)参与胆管癌细胞增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭，并具有抑制结直肠癌的增殖和调控PTEN/PI3K/Akt通路的作用。然而miR-21能否通过靶向PTEN/PI3K/Akt信号通路调控胆管癌细胞的恶性生物学行为仍不清楚。鉴于此，本研究选取人胆管癌细胞株QBC939开展细胞实验，揭示miR-21靶向PTEN/PI3K/Akt通路调控人胆管癌细胞株QBC939恶性行为的分子机制。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验细胞与试剂
人胆管癌细胞株QBC939(由武汉细胞研究所提供)；脂质体转染(LipofectamineTM 2000)试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司，生产批号：11668-027)；人miR-21模拟物(hsa-miR-21 mimics，合成序列：5′-UAGCUUAUCAGCUGAUGUUGA-3′)(pGFP-hsa-miR-21 mimics)过表达质粒、hsa-miR-21抑制剂(hsa-miR-21 inhibitor，合成序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)(pGFP-hsa-miR-21 inhibitor)质粒、hsa-miR-21 inhibitor阴性对照(negative control inhibitor，NC inhibitor，合成序列：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUAGUACAA-3′)(pGFP-NC inhibitor)质粒、miR-21 mimics、miR-21 mimics阴性对照(negative control mimics，NC mimics)(合成序列：5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′)[均由和元生物技术(上海)股份有限公司合成]；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液(购自上海麦克林生化科技有限公司，生产批号：M864643)；凋亡检测试剂盒(购自杭州诺扬生物技术有限公司，生产批号：FXP023-020-20)；基质胶(Matrigel)(购自上海慧颖生物科技有限公司，生产批号：356234)；侵袭小室(Transwell)(购自北京明阳科华生物科技有限公司，生产批号：BD-353503)；miR-21、PTEN、PI3K、Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和内参β-肌动蛋白(β-actin)基因所需实时-逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)引物、野生型和突变型PTEN-3′UTR引物(均由重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司合成)；总RNA提取试剂盒[购自天根生化科技(北京)有限公司，生产批号：DP419]；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司，生产批号：PC0020)；兔抗人PTEN、PI3K、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、mTOR和β-actin单克隆抗体(一抗)、羊抗兔PTEN、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和β-actin荧光标记多克隆抗体(二抗)(均购自上海联迈生物工程有限公司，生产批号：H00005728-K、ab226826、PAB1310、PAB19236、PAB18865、ab179467、ab195056、ab40755、ab372015、ab531250、5048S、ab11003)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒[购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司，生产批号：11401]；PureLinkTM Pro 96基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取试剂盒(购自赛默飞世尔科技公司，生产批号：K182104A)；不产色链霉菌第二型(Streptomyces achromogenes Ⅱ，Sac Ⅱ)和流感嗜血杆菌d第三型(Haemophilus influenzae d Ⅲ，Hind Ⅲ)内切酶(均购自北京博迈斯科技发展有限公司，生产批号：R0157S、R0104V)；pmiRGLO载体(购自湖南科爱医疗器械有限公司，生产批号：VT1439)；质粒提取试剂盒(购自上海力敏实业有限公司，生产批号：12145)。
1.1.2 实验设备
MTP-601F型酶标仪[购自天美(中国)科学仪器有限公司]；Agilent NovoCyte Quanteon型流式细胞仪[购自安捷伦科技(中国)有限公司]；BD-YG3002型荧光显微镜(购自深圳市博视达光学仪器有限公司)；TS100型倒置显微镜(购自武汉医捷迅安商贸有限公司)；H12943型划痕仪(购自北京恒奥德仪器仪表有限公司)；MA-6000型PCR仪(购自苏州雅睿生物技术股份有限公司)；MS型实时凝胶电泳系统(购自北京兴联商贸有限公司)；Image J v1.8.0软件(购自美国国立卫生研究院)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及转染
将人胆管癌细胞株QBC939接种至含10%胎牛血清的无菌1640液体细胞培养基(RPMI-1640)中，37 ℃、5% CO2恒温箱培养。将培养至对数期的癌细胞接种至6孔板，待细胞贴壁至70%左右时更换培养液。以LipofectamineTM 2000脂质体法进行转染，严格按照试剂盒说明进行操作：加入转染试剂后，逐滴加入hsa-miR-21 mimics过表达报告基因质粒，培养4~6 h后更换培养基继续培养48 h，将该组细胞记为过表达组；同法获得转染hsa-miR-21 inhibitor报告基因质粒和NC inhibitor报告基因质粒的QBC939细胞，分别记为沉默组和空载组；同时将未经处理的QBC939细胞株记为空白对照组。每组5个复孔，并通过荧光显微镜检测转染效率。
1.2.2 MTT比色法检测各组细胞增殖抑制率
胰蛋白酶消化，每孔加20 μL 5 mg/mL MTT溶液，4 h后弃培养液，加入150 μL二甲基亚砜，振荡5 min，在酶标仪上用490 nm波长测定OD值，计算0~72 h每组细胞增殖活性。每组实验重复3次，取OD的平均值。
1.2.3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率
胰蛋白酶消化，离心，预冷磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞，调整细胞浓度1×106个/mL。加入10 μL磷脂结合蛋白V避光室温反应10 min，预冷PBS洗涤，加入4 μL碘化丙啶，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭能力
向Transwell中加60 μL 1.5 mg/mL的Matrigel，均匀铺在小室上层滤膜，37 ℃孵育1 h成膜以模拟基底膜结构。调整细胞浓度为1×105个/mL，将细胞加入Transwell小室上室内，每孔200 μL，下孔加入RPMI-1640培养基后于37 ℃、5% CO2恒温箱培养24 h。随后分别经过PBS洗涤、多聚甲醛固定、蒸馏水洗涤结晶紫染色以及洗涤风干等步骤后获取基底膜。倒置显微镜下分4个区域，每个区域随机选取1个视野，观察拍照并计数。每组3张膜，穿膜细胞数取平均值。
1.2.5 细胞划痕实验
将各组细胞接种到6孔板中，细胞达到95%融合，用划痕仪对准6孔板下端中央部位轻轻划痕。RPMI-1640培养基轻轻漂洗3次后，37 ℃、5%CO2恒温箱培养48 h，倒置显微镜拍照，观察划痕愈合情况。
1.2.6 RT-qPCR检测miR-21、PI3K、Akt、mTOR和PTEN mRNA表达
提取各组细胞总RNA。逆转录合成cDNA，根据引物序列进行PCR反应。反应条件：95 ℃ 5 s变性；55 ℃ 30 s退火；72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃10 min。引物序列见表 1。本研究选取β-actin作为内参基因，采用相对定量法[11]比较各组细胞待测基因mRNA表达差异。待测基因ΔΔCt值=[待测基因mRNA平均Ct值(转染组)-β-actin mRNA平均Ct值(转染组)]-[待测基因mRNA平均Ct值(空白对照组)-β-actin mRNA平均Ct值(空白对照组)]。以2-ΔΔCt表示各组待测基因mRNA表达的倍比关系。
表 1 PCR反应引物序列Table 1. The primer sequences of PCR reaction基因 引物序列 扩增产物长度(bp) miR-21 上游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ 72 下游引物5′-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3′ PI3K 上游引物5′-CAAAGCCGAGAACCTATTGC-3′ 384 下游引物5′-TTGAGGGAGTCATTGTGCTG-3′ Akt 上游引物5′-TGGACTACTTGCACTCCGAG-3′ 175 下游引物5′-CGCAGAACGTCTTCATGGTG-3′ mTOR 上游引物5′-ATGACGAGACCCAGGCTAAG-3′ 225 下游引物5′-GCCAGTCCATGCCATCAG-3′ PTEN 上游引物5′-TTATTGCTATGGGATTTCCTGC-3′ 198 下游引物5′-GCTGTGGTGGGTTATGGTCTTC-3′ β-actin 上游引物5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′ 443 下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′ 1.2.7 蛋白质免疫印迹法(Western blotting，WB)检测PTEN、PI3K、Akt和mTOR蛋白表达
收集各组细胞，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白质。BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白终浓度为5 μg/μL。WB凝胶电泳，然后转移至聚偏二氟乙烯膜，脱脂奶粉封闭，加入一抗，4 ℃孵育过夜，将聚偏二氟乙烯膜置于含有二抗试管中，室温孵育，显色反应，扫描胶片后用Image J软件分析蛋白印迹灰度值。
1.2.8 双荧光素酶报告基因实验
采用TargetScan数据库[12]预测miR-21的靶基因。构建野生型和突变型PTEN-3′UTR报告基因质粒。野生型PTEN-3′UTR报告基因质粒：获取细胞总DNA后，根据设计好的引物(引物包含Sac Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位点)，以细胞总DNA为模板经2次PCR扩增出所需片段；对琼脂糖电泳回收的PCR扩增条带进行Sac Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切，同时将报告质粒pmiRGLO进行双酶切，回收两者双酶切电泳条带；连接两者双酶切产物；将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；选取合适单菌落，提取重组质粒，经鉴定序列信息与NCBI数据库收录序列一致。野生型PTEN-3′UTR引物序列：上游引物5′-CCACCAGAGCTCTCTTGTGCTGTGCAGCAG-3′，下游引物5′-CCAACGAAGCCTGTGATGGCATTCACTGAACC-3′。突变型PTEN-3′UTR报告基因质粒：通过引物搭桥法对PTEN-3′UTR进行定点突变，用设计好的上下游引物分别PCR扩增出PTEN-3′UTR上游和下游突变产物；搭桥PCR程序进行搭桥连接，以搭桥PCR产物为模板，PCR扩增并电泳回收，后续过程同野生型PTEN-3′UTR报告基因质粒构建过程一致，经鉴定连接产物的序列一致。突变型PTEN-3′UTR引物序列：上游引物5′-AACCGCGGTAAGAGAAATAAGCACCGTTTTCCAAG-3′，下游引物5′-AAAACGGTGCTTATTTCTCTTACCGCGGTTCAGATGTCTGAAGAT-3′。将野生型和突变型PTEN-3′UTR报告基因质粒、miR-21 mimics及NC mimics转染至QBC939细胞中，48 h后进行双荧光素酶检测。各组相对荧光强度=各组萤火虫荧光强度/海肾荧光强度。
1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组细胞转染效率
荧光显微镜下观察，转染成功细胞表达绿色荧光，未转染成功细胞无荧光。空载组、过表达组和沉默组转染效率分别为(90.27±18.03)%、(91.43±18.26)%和(92.16±18.41)%(图 1)。
图 1 转染后QBC939细胞荧光图(×100)Figure 1. Photofluorograms of QBC939 cells after transfection (×100)2.2 各组细胞增殖活性和凋亡率
MTT结果显示，在转染处理后24~72 h，与空白对照组和空载组比较，过表达组QBC939细胞增殖活性明显提高(P值均＜0.05)(图 2)，凋亡率显著下降(P值均＜0.01)(图 3，表 2)；与空白对照组、空载组和过表达组比较，沉默组细胞增殖活性显著降低(P值均＜0.01)(图 2)，而凋亡率显著上升(P值均＜0.01)(图 3，表 2)。
图 2 各组QBC939细胞增殖活性Figure 2. The proliferative activities of QBC939 cells in each group
图 3 流式细胞检测各组QBC939细胞凋亡率Figure 3. Flow cytometry examined apoptosis rates of QBC939 cells in each group表 2 各组QBC939细胞凋亡率Table 2. The apoptosis rates of QBC939 cells in each group组别 细胞凋亡率(%) 空白对照组 5.74±1.13 空载组 6.08±1.20 过表达组 3.49±0.651)2) 沉默组 29.87±5.891)2)3) F值 81.767 P值 ＜0.001 注：与空白对照组比较，1)P＜0.01；与空载组比较，2)P＜0.01；与过表达组比较，3)P＜0.01。 2.3 各组细胞迁移和侵袭活性
与空白对照组和空载组比较，过表达组QBC939细胞迁移率和穿膜数目均显著增高(P值均＜0.01)；与空白对照组、空载组和过表达组比较，沉默组迁移率和穿膜数目均显著下降(P值均＜0.01)(表 3，图 4、5)。
表 3 各组QBC939细胞体外侵袭实验结果Table 3. Results of in vitro invasion experiments of QBC939 cells in each group组别 迁移率(%) 穿膜数目(个) 空白对照组 49.21±9.81 253.53±50.61 空载组 49.03±9.78 251.49±50.25 过表达组 80.17±16.021)2) 413.01±82.561)2) 沉默组 28.64±5.711)2)3) 137.96±27.571)2)3) F值 18.784 20.194 P值 ＜0.001 ＜0.001 注：与空白对照组比较，1)P＜0.01；与空载组比较，2)P＜0.01；与过表达组比较，3)P＜0.01。 
图 5 Transwell小室试验结果(结晶紫染色，×100)Figure 5. Transwell experiment results(crystal violet staining, ×100)2.4 各组细胞miR-21、PI3K、Akt、mTOR和PTEN mRNA表达
与空白对照组和空载组比较，过表达组miR-21、PI3K、Akt和mTOR mRNA表达均升高，PTEN mRNA表达下降，差异均有统计学意义(P值均＜0.05)；与空白对照组、空载组和过表达组比较，沉默组miR-21、PI3K、Akt和mTOR mRNA表达均下降，PTEN mRNA表达升高，差异均有统计学意义(P值均＜0.05)(图 6)。
图 6 各组细胞miR-21、PI3K、Akt、mTOR和PTEN mRNA表达的倍比关系注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与空载组比较，△P＜0.05；与过表达组比较，P＜0.05。Figure 6. The multiple ratio relationships of the expressions of miR-21, PI3K, Akt, mTOR, and PTEN mRNA in each group2.5 各组细胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白表达
与空白对照组和空载组比较，过表达组PI3K、Akt、p-Akt和mTOR蛋白表达均显著升高，PTEN蛋白表达显著下降(P值均＜0.01)；与空白对照组、空载组和过表达组比较，沉默组PI3K、Akt、p-Akt和mTOR蛋白表达均显著下降，PTEN蛋白表达显著升高(P值均＜0.01)(图 7，表 4)。
图 7 各组细胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白表达量Figure 7. Expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, mTOR, and PTEN proteins in each group表 4 各组细胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白相对表达量Table 4. Relative expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, mTOR, and PTEN proteins in each group组别 PI3K Akt p-Akt mTOR PTEN 空白对照组 1.35±0.26 0.45±0.09 0.51±0.09 0.79±0.15 0.43±0.08 空载组 1.33±0.24 0.44±0.07 0.49±0.08 0.78±0.14 0.42±0.06 过表达组 2.21±0.411)2) 0.84±0.161)2) 0.95±0.181)2) 1.81±0.361)2) 0.23±0.041)2) 沉默组 0.72±0.131)2)3) 0.19±0.031)2)3) 0.11±0.021)2)3) 0.41±0.081)2)3) 0.71±0.141)2)3) F值 24.197 36.489 43.880 40.639 25.059 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与空白对照组比较，1)P＜0.01；与空载组比较，2)P＜0.01；与过表达组比较，3)P＜0.01。 2.6 miR-21靶向PTEN的验证
TargetScan数据库预测PTEN为miR-21潜在靶基因，PTEN基因3′UTR与miR-21有6个碱基位点互补配对(图 8)。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-21 mimics和野生型PTEN-3′UTR质粒共转染细胞的相对荧光强度较NC mimics和野生型PTEN-3′UTR质粒共转染细胞显著降低(P＜0.05)；miR-21 mimics和突变型PTEN-3′UTR质粒共转染细胞中相对荧光强度较NC mimics和突变型PTEN-3′ UTR质粒共转染细胞差异无统计学意义(P＞0.05)(图 9)。
图 8 数据库预测miR-21和PTEN的互补序列Figure 8. Database predicts complementary sequences of miR-21-3p and PTEN
图 9 双荧光素酶检测结果注：与转染NC mimics细胞比较，P＜0.05。Figure 9. Results of the double luciferase assay3. 讨论
胆管癌作为高度恶性的实体肿瘤，其传统手术切除率低，患者预后差，严重威胁人类健康。现如今靶向药物的开发和应用为肿瘤治疗提供了新的思路。既往研究[8-10]表明miR-21可调控抑癌基因PTEN表达，而PTEN/PI3K/Akt信号通路在胆管癌增殖分化过程中发挥重要作用。然而miR-21能否靶向PTEN/PI3K/Akt信号通路调节胆管癌恶性行为未知。鉴于此，本研究选取胆管癌细胞株QBC939，研究miR-21基因干扰靶向PTEN/PI3K/Akt信号通路调节胆管癌恶性行为的分子机制。
本研究结果显示, 在QBC939细胞中过表达miR-21可增加细胞的增殖活性、减少细胞的凋亡并提高细胞的迁移率和穿膜数目；当沉默miR-21后，细胞的增殖活性降低、细胞凋亡率增加、迁移率和穿膜能力降低。说明miR-21过表达可显著促进癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制癌细胞凋亡，促进胆管癌细胞恶性行为。有研究[13]指出，胆管癌细胞高增殖率和低凋亡率与胆管癌细胞活性增强相关，癌细胞迁移和侵袭与基质金属蛋白酶9和波形蛋白的表达水平相关，据此推测本研究中miR-21调节胆管癌细胞的增殖活性、凋亡率、迁移和侵袭行为可能与调节癌细胞的细胞活性、基质金属蛋白酶9以及波形蛋白表达水平相关。
为进一步明确miR-21是否能作用于PTEN/PI3K/Akt通路，进而调控胆管癌细胞的增殖、迁移和浸润等恶性行为，本研究发现当转染miR-21 mimics过表达miR-21时，PI3K、Akt和mTOR mRNA和蛋白质表达水平均升高，而PTEN mRNA和蛋白质表达水平均下降，说明活化miR-21可增加PI3K/Akt通路的活性。当抑制miR-21表达时，PI3K、Akt和mTOR mRNA和蛋白质表达水平均下降，PTEN mRNA和蛋白质表达水平均升高，表明抑制miR-21可抑制PI3K/Akt通路的活性。一般Akt的激活都是磷酸化的途径，总量基本稳定，但p-Akt水平改变。但是在本研究中，随着miR-21的过表达或沉默，Akt总量也发生了改变。既往研究[14]表明，泛素化是一种对靶蛋白进行特异性修饰的过程，可调控细胞增殖、细胞周期、凋亡等多种进程，泛素－蛋白酶体系统在肿瘤进程中发挥重要作用。据此推测miR-21可能通过泛素化干扰了Akt蛋白的降解过程，过表达miR-21导致Akt降解受阻，Akt总量增加，而沉默miR-21促进Akt的降解导致总量下降。也可能是miR-21影响了Akt蛋白的表达。
本研究中双荧光素酶结果显示，miR-21 mimics可显著抑制野生型PTEN-3′UTR质粒转染细胞相对荧光强度，但是对突变型PTEN-3′UTR质粒转染细胞无影响，证明PTEN为miR-21的直接作用靶点。近年来肿瘤靶向治疗逐渐重视miRNA的靶向作用[15]。miRNA是一种非编码单链小分子RNA，作为转录后负调节因子，可与靶基因mRNA互补，结合到靶基因mRNA的3′UTR，抑制靶标基因蛋白翻译或使其降解，参与原癌和抑癌基因的调节作用，调节细胞代谢过程[16]。miR-21由22个核苷酸组成，参与癌症的发生发展，在肿瘤中呈过表达现象[17]。有研究[18-19]报道miR-21可促进乳腺癌的增殖和转移，参与调控食管鳞癌细胞增殖和凋亡。PI3K是一种磷脂酰肌醇激酶，Akt是一种蛋白激酶，mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，三者均参与细胞的增殖、分化和凋亡；活化的PI3K磷酸化Akt，p-Akt水平升高，使Akt处于活化状态，在肿瘤中PI3K/Akt信号通路被异常激活后促进肿瘤细胞的增殖、迁移，促进肿瘤生长，是肿瘤靶向治疗的关键分子，同时mTOR可活化PI3K/Akt信号通路[20-21]。PTEN作为抑癌基因，可抑制胆管癌细胞生长并负调节PI3K/Akt信号通路；而PTEN表达被抑制时，PTEN/PI3K/Akt信号转导通路失衡进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移并抑制凋亡，最终导致肿瘤发生[22-23]。有研究[24]证明miR-21可调节PTEN/PI3K/ AKT信号通路调控卵巢癌细胞的增殖和凋亡。本研究结果与既往研究结果一致，据此推测miR-21可能通过靶向抑制抑癌基因PTEN的表达，从而诱导PI3K/Akt磷酸化，促进癌细胞的侵袭和转移，增强胆管癌的恶性行为。
综上所述，miR-21基因干扰可有效抑制胆管癌细胞的恶性行为，具体机制可能通过靶向调控PTEN/PI3K/Akt信号通路信号传导，抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移，促进癌细胞凋亡。为进一步研究miR-21对胆囊癌细胞恶性生物学行为提供了一定理论依据，针对miR-21的小分子抑制剂有望成为潜在的胆管癌治疗方案。
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图 1 转染后QBC939细胞荧光图(×100)
Figure 1. Photofluorograms of QBC939 cells after transfection (×100)
图 2 各组QBC939细胞增殖活性
Figure 2. The proliferative activities of QBC939 cells in each group
图 3 流式细胞检测各组QBC939细胞凋亡率
Figure 3. Flow cytometry examined apoptosis rates of QBC939 cells in each group
图 5 Transwell小室试验结果(结晶紫染色，×100)
Figure 5. Transwell experiment results(crystal violet staining, ×100)
注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与空载组比较，△P＜0.05；与过表达组比较，P＜0.05。
图 6 各组细胞miR-21、PI3K、Akt、mTOR和PTEN mRNA表达的倍比关系
Figure 6. The multiple ratio relationships of the expressions of miR-21, PI3K, Akt, mTOR, and PTEN mRNA in each group
图 7 各组细胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白表达量
Figure 7. Expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, mTOR, and PTEN proteins in each group
图 8 数据库预测miR-21和PTEN的互补序列
Figure 8. Database predicts complementary sequences of miR-21-3p and PTEN
注：与转染NC mimics细胞比较，P＜0.05。
图 9 双荧光素酶检测结果
Figure 9. Results of the double luciferase assay
表 1 PCR反应引物序列
Table 1. The primer sequences of PCR reaction
基因 引物序列 扩增产物长度(bp) miR-21 上游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ 72 下游引物5′-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3′ PI3K 上游引物5′-CAAAGCCGAGAACCTATTGC-3′ 384 下游引物5′-TTGAGGGAGTCATTGTGCTG-3′ Akt 上游引物5′-TGGACTACTTGCACTCCGAG-3′ 175 下游引物5′-CGCAGAACGTCTTCATGGTG-3′ mTOR 上游引物5′-ATGACGAGACCCAGGCTAAG-3′ 225 下游引物5′-GCCAGTCCATGCCATCAG-3′ PTEN 上游引物5′-TTATTGCTATGGGATTTCCTGC-3′ 198 下游引物5′-GCTGTGGTGGGTTATGGTCTTC-3′ β-actin 上游引物5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′ 443 下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′ 
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表 2 各组QBC939细胞凋亡率
Table 2. The apoptosis rates of QBC939 cells in each group
组别 细胞凋亡率(%) 空白对照组 5.74±1.13 空载组 6.08±1.20 过表达组 3.49±0.651)2) 沉默组 29.87±5.891)2)3) F值 81.767 P值 ＜0.001 注：与空白对照组比较，1)P＜0.01；与空载组比较，2)P＜0.01；与过表达组比较，3)P＜0.01。
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表 3 各组QBC939细胞体外侵袭实验结果
Table 3. Results of in vitro invasion experiments of QBC939 cells in each group
组别 迁移率(%) 穿膜数目(个) 空白对照组 49.21±9.81 253.53±50.61 空载组 49.03±9.78 251.49±50.25 过表达组 80.17±16.021)2) 413.01±82.561)2) 沉默组 28.64±5.711)2)3) 137.96±27.571)2)3) F值 18.784 20.194 P值 ＜0.001 ＜0.001 注：与空白对照组比较，1)P＜0.01；与空载组比较，2)P＜0.01；与过表达组比较，3)P＜0.01。
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表 4 各组细胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白相对表达量
Table 4. Relative expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, mTOR, and PTEN proteins in each group
组别 PI3K Akt p-Akt mTOR PTEN 空白对照组 1.35±0.26 0.45±0.09 0.51±0.09 0.79±0.15 0.43±0.08 空载组 1.33±0.24 0.44±0.07 0.49±0.08 0.78±0.14 0.42±0.06 过表达组 2.21±0.411)2) 0.84±0.161)2) 0.95±0.181)2) 1.81±0.361)2) 0.23±0.041)2) 沉默组 0.72±0.131)2)3) 0.19±0.031)2)3) 0.11±0.021)2)3) 0.41±0.081)2)3) 0.71±0.141)2)3) F值 24.197 36.489 43.880 40.639 25.059 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与空白对照组比较，1)P＜0.01；与空载组比较，2)P＜0.01；与过表达组比较，3)P＜0.01。
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