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化痰祛湿活血方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型肝细胞线粒体超微结构的影响
DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.08.012
Effect of Huatan Qushi Huoxue prescription on the ultrastructure of hepatocyte mitochondria in rats with nonalcoholic steatohepatitis
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摘要:
目的 探讨化痰祛湿活血方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型肝细胞形态的影响。 方法 48只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、易善复组、化痰祛湿活血方组，每组12只。模型组和药物组大鼠第2周开始给药及造模，空白组给予普通饲料，另外3组给予高脂饲料。依据人与动物剂量折算法：化痰祛湿活血方等效剂量为1.26 g/100 g体质量，多烯磷脂酰胆碱胶囊(易善复)等效剂量为0.014 18 g/100 g体质量。模型组灌胃0.9% 氯化钠溶液，易善复组灌胃多烯磷脂酰胆碱混悬液，中药组给予灌胃化痰祛湿活血方颗粒混悬液，1次/d，连续10周。透射电子显微镜观察各组大鼠肝脏超微结构级定量分析。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较，方差齐者采用LSD-t检验，方差不齐者采用Dunnett’s T3检验。 结果 模型组可见肝细胞内有大量脂滴积累，线粒体形态和结构改变，数量减少，内质网数量减少。化痰祛湿活血方组肝细胞内脂滴明显减少，线粒体和内质网数量较模型组明显增加，线粒体膜及结构完整。易善复组肝细胞脂滴相对减少，线粒体数量增加，内质网数量减少，线粒体膜及结构相对完整。定量分析结果显示，与空白组相比，模型组脂滴面积明显增多，线粒体减少，体密度比较差异均有统计学意义(P值均＜0.01)；药物干预后，易善复组脂滴面积减少、线粒体数目增多，与模型组体密度比较差异均有统计学意义(P值均＜0.01)；中药组较易善复组脂滴面积减少更多、线粒体数目明显增加，体密度比较差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。 结论 化痰祛湿活血方可改善脂质积累，增加线粒体体密度，保护线粒体结构和功能且疗效高于易善复。 -
关键词:
- 非酒精性脂肪性肝病 /
- 化痰祛湿活血方 /
- 线粒体, 肝 /
- 大鼠, Sprague-Dawley
Abstract:Objective To investigate the effect of Huatan Qushi Huoxue prescription on the ultrastructure of hepatocyte mitochondria in a rat model of nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Methods A total of 48 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank group, model group, Yishanfu group, and Huatan Qushi Huoxue prescription group, with 12 rats in each group. The rats in the model group and the drug groups were administered and modeled since week 2; the rats in the blank group were given normal diet, and those in the other three groups were given high-fat diet. Based on dose conversion between human and animal, the equivalent dose of Huatan Qushi Huoxue prescription was 1.26 g/100 g body weight, and the equivalent dose of polyene phosphatidylcholine capsules (Yishanfu) was 0.014 18 g/100 g body weight. The rats in the model group were given 0.9% sodium chloride by gavage, those in the Yishanfu group were given polyene phosphatidylcholine suspension by gavage, and those in the traditional Chinese medicine group were given the granules of Huatan Qushi Huoxue prescription by gavage, once a day for 10 consecutive weeks. A transmission electron microscope was used to observe liver ultrastructure and perform a quantitative analysis. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups; for further pairwise comparison, the least significant difference t-test was used for data with homogeneity of variance, and the Dunnett's T3 was used for data with heterogeneity of variance. Results The model group had a large number of lipid droplets accumulated in hepatocytes, changes in mitochondrial morphology and structure, and reductions in the number of mitochondria and endoplasmic reticulum. The Huatan Qushi Huoxue prescription group had a significant reduction in lipid droplets in hepatocytes and significant increases in the number of mitochondria and endoplasmic reticulum compared with the model group, with intact mitochondrial membrane and structure. The Yishanfu group had a reduction in lipid droplets in hepatocytes, an increase in the number of mitochondria, and a reduction in the number of endoplasmic reticulum, with relatively intact mitochondrial membrane and structure. The quantitative analysis showed that compared with the blank group, the model group had a significant increase in the area of lipid droplets and a significant reduction in mitochondria, with a significant difference in mitochondrial density between the two groups (all P < 0.01); after drug intervention, the Yishanfu group had a significant reduction in the area of lipid droplets and a significant increase in the number of mitochondria, with a significant difference in mitochondrial density between the Yishanfu group and the model group (all P < 0.01); compared with the Yishanfu group, the traditional Chinese medicine group had a significantly greater reduction in the area of lipid droplets and a significant increase in the number of mitochondria, with a significant difference in mitochondrial density between the two groups (all P < 0.05). Conclusion Huatan Qushi Huoxue prescription can improve lipid accumulation, increase mitochondrial density, and protect mitochondrial structure and function, with a better clinical effect than Yishanfu. -
随着肥胖的流行和代谢综合征(MetS)患病率的迅速增长, 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为健康体检肝脏生化指标异常的首要原因[1]。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是临床干预的关键节点，若此阶段未加干预，有进展成肝纤维化、肝硬化的风险。目前, 尚无治疗NASH的特效药物。化痰祛湿活血方是全国名中医赵文霞教授的经验方，其治疗NASH临床疗效确切[2]，前期动物实验[3-5]表明，化痰祛湿活血方可降低NASH大鼠肝酶、调节脂代谢、提高肝脏抗氧化能力，抑制炎症反应，防止肝细胞发生坏死和凋亡。但尚缺乏以线粒体超微结构为切入点，探讨其作用机制的研究。因此本研究将以高脂饲料诱导NASH大鼠模型，以临床常用药易善复为阳性对照药。透射电镜下观察肝细胞超微结构，探索化痰祛湿活血方在亚细胞水平上的作用靶点。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
SD雄性大鼠48只，SPF级，体质量(150±10) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物合格证号：11400700116588；许可证号：SXYK(豫) 2015-0005。
1.2 实验药物
化痰祛湿活血方颗粒剂: 泽泻，批号: 15120135; 丹参，批号: 15060138; 海藻，批号: 15070027; 郁金，批号: 15060128; 决明子，批号: 15090036; 山楂，批号: 15060020；柴胡，批号: 15070208；水飞蓟，批号: 15070223; 由四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供。多烯磷脂酰胆碱胶囊(易善复): 赛诺菲(北京) 制药有限公司，批号: 5JD070。
1.3 主要试剂与仪器
高脂饲料: 普通饲料(84%)、猪油(10%)、蛋黄粉(5%)、胆固醇(1%)。饲料由河南省实验动物中心加工而成。透射电镜(FEI，美国)，倒置荧光显微镜(奥林巴斯，日本)
1.4 分组、造模及给药
48只SD大鼠适应性喂养1周，第2周分组并开始造模及给药。大鼠随机分为空白组，模型组，易善复组，化痰祛湿活血方组(简称中药组)，每组12只。空白组给予普通饲料，另外3组给予高脂饲料。依据人与动物剂量折算法：化痰祛湿活血方等效剂量为1.26 g/100 g体质量，多烯磷脂酰胆碱胶囊(易善复)等效剂量为0.014 18 g/100 g体质量。模型组灌胃0.9%氯化钠溶液，易善复组灌胃多烯磷脂酰胆碱混悬液，中药组给予灌胃化痰祛湿活血方颗粒混悬液，1次/d，连续10周。
1.5 透射电子显微镜观察各组大鼠肝脏超微结构及定量分析
实验步骤：灌胃10周结束后，用电子秤称取鼠重，大鼠予10%水合氯醛麻醉，迅速取出各组肝组织，修成1 mm×1 mm×1 mm的小块，置于4℃，2.5%的戊二醛固定，4℃、1%锇酸后固定。以乙醇及丙酮脱水，环氧树脂包埋，制成1 μm厚的半薄片，用钻石刀切制成70 nm厚的超薄切片，铀铅染色后透射电镜观察肝细胞线粒体形态数量及其他细胞器等超微结构。定量分析：采用国际上通用的细胞立体计量学点分析法，对实验各组选择2只动物，每只动物取3块肝组织，每块组织观察5个细胞进行定量测定，测定肝细胞内脂滴和线粒体的指标为体密度。
1.6 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较，方差齐者采用LSD-t检验，方差不齐者采用Dunnett's T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 化痰祛湿活血方对肝细胞超微结构的影响
2.1.1 空白组表现
电镜下可见大鼠肝细胞形态正常，细胞膜完整，细胞核较大居中，核膜完整，核仁清晰，胞内有大量丰富的线粒体和内质网，高倍镜下可见结构清晰完整的线粒体及大量内质网(图 1)。
图 1 电镜下空白组大鼠肝细胞超微结构注：a，空白组大鼠肝细胞形态正常(×5000)，箭头为脂滴；b，放大倍数后可见清晰完整线粒体及大量内质网(×50 000)，箭头为线粒体。Figure 1. Ultrastructure of liver cells in blank group under electron microscope2.1.2 模型组表现
低倍镜下可见模型组大鼠肝细胞内有大量脂滴积累，占细胞面积1/2~2/3，部分肝细胞核被脂滴挤压变形或挤向细胞边缘。线粒体较正常组体积增大，脂滴与线粒体互相挤压；内质网数量明显减少。高倍镜下可见线粒体周围围绕的内质网数量明显少于正常组，结构不清晰；线粒体结构被破坏，双层膜模糊或消失，与胞质分界不清晰；线粒体嵴排列紊乱或数量减少(图 2)。
图 2 电镜下模型组大鼠肝细胞超微结构注：a, 模型组大鼠肝细胞内大量脂滴积累(×2500)，箭头为脂滴; b, 放大倍数后可见线粒体结构破坏、内质网数量减少(×50 000)，箭头为线粒体。Figure 2. Ultrastructure of rat liver cells in model group under electron microscope2.1.3 中药组表现
低倍镜下可见细胞内脂滴沉积较模型组明显减少，线粒体、内质网数量较模型组增多，且结构较清晰。高倍镜下可见线粒体形态明显较模型组好转，双层膜结构较完整(图 3)。
图 3 电镜下中药组大鼠肝细胞超微结构注：a，中药组大鼠肝细胞内脂滴明显减少(×2500)；b，放大倍数后可见线粒体膜较完整(×50 000)，箭头为线粒体。Figure 3. Ultrastructure of rat liver cells in Chinese medicine group under electron microscope2.1.4 易善复组表现
低倍镜下可见大鼠肝细胞内脂滴沉积，数量较模型组减少，占细胞面积1/3以下；线粒体数量较模型组明显增多，内质网减少，线粒体结构清晰。高倍镜下可见大部分线粒体结构完整，双层膜清晰，线粒体嵴排列整齐，少数线粒体双层膜破坏，或双层膜结构完整，但线粒体嵴被破坏(图 4)。
图 4 电镜下易善复组肝细胞超微结构注：a, 对照组大鼠肝细胞内脂滴减少(×2500)，箭头为脂滴; b，放大倍数后可见线粒体结构较完整(×50 000)，箭头为线粒体。Figure 4. Ultrastructure of Essentiale control liver cells under electron microscope2.2 化痰祛湿活血方对大鼠肝细胞线粒体影响的定量分析
与空白组相比，模型组脂滴面积明显增多，线粒体减少，体密度比较差异均有统计学意义(P值均＜0.01)；药物干预后，易善复组脂滴面积减少、线粒体数目增多，与模型组体密度比较差异有统计学意义(P值均＜0.01)；中药组较易善复组脂滴面积减少更多、线粒体数目明显增加，体密度比较差异有统计学意义(P值均＜0.05)(表 1)。
表 1 各组大鼠脂滴和线粒体体密度比较Table 1. Lipid droplet and mitochondrial body density were compared in each group组别 例数 脂滴体密度 线粒体体密度 空白组 30 0.12 ±0.10 49.76±2.19 模型组 30 42.11 ±2.341) 20.84±5.011) 易善复组 30 13.74 ±9.722) 32.18±2.922) 中药组 30 1.55 ±0.902)3) 34.02±2.962)3) F值 451.4 360.0 P值 ＜0.000 1 ＜0.000 1 注：与空白组相比，1)P＜0.01；与模型组相比，2)P＜0.01；与易善复组相比，3)P＜0.05。 3. 讨论
线粒体是肝脏脂肪酸β氧化最主要的细胞器。非酒精性脂肪性肝病初期肝细胞内脂滴沉积，诱发脂肪变性，肝细胞内大量游离脂肪酸转变成脂酰辅酶A，然后进入线粒体进行β氧化[6]。脂质贮积增多，肝脏对游离脂肪酸摄取的增加使线粒体β氧化速度代偿性增加，进而增加活性氧(ROS)的产出，当超过抗氧化物质的清除能力导致ROS蓄积时，此时ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多聚不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质反应形成有毒的脂质，从而使线粒体的结构和功能发生改变，并破坏线粒体膜的稳定性，引发肝细胞程序性死亡，通过亚致死性和致死性应激效应引起肝细胞的损伤。因此，维持肝细胞线粒体结构、数量、功能的正常，在NASH治疗中不可忽视。
NASH病因与饮食不节、形体肥胖、多卧少动密切相关，脾气亏虚，运化失职致肝失条达、痰湿内停、瘀血阻络是本病的主要病机[7]。患者过食肥甘厚味、劳逸失度、情志失调，导致肝失疏泄、脾失健运，脾胃运化失职，水湿内停，湿炼为痰，痰阻气机，气滞血瘀，“湿、痰、瘀”交阻肝络而发病。探索“痰湿瘀”的病理生理物质基础，进一步阐明针对痰、湿、瘀的“化痰祛湿活血”干预NASH形成的微观联系具有重要意义。
笔者依据NASH“痰湿内停、瘀血阻络、肝失条达”的主要病机创立了化痰祛湿活血方(泽泻、丹参、郁金、海藻、决明子、山楂、水飞蓟、柴胡)。前期研究[8]已证实化痰祛湿活血方可显著降低NASH患者血清ALT、胰岛素抵抗，提高肝/脾CT值，降低甘油三酯、BMI，改善临床症状方面均明显优于对照组。同时笔者的基础研究[3, 5]也发现，化痰祛湿活血方能够降低NASH模型大鼠相关炎症因子、氧化应激因子，从而改善肝组织炎症损伤及肝纤维化程度，具有良好的抗NASH作用。
本研究发现，电镜下模型组的肝细胞线粒体形态较正常组大，定量分析发现线粒体体密度减少，说明氧化应激损伤导致线粒体膜通透性增加，细胞器水肿。经化痰祛湿活血方干预后，线粒体数量增加，形态明显好转，肿胀减轻或消失，双层膜结构较完整，膜密度增加。说明化痰祛湿活血方有减轻线粒体肿胀、改善线粒体膜通透性、恢复线粒体形态的作用。经过化痰祛湿活血方干预后，NASH大鼠肝脏内脂滴明显减少，提示该方可能通过减轻肝细胞脂质沉积来降低胞内氧化应激反应，进而减轻线粒体功能的损伤。本研究还发现化痰祛湿活血方组内质网数量较模型组明显增多，分布广泛，提示本方有改善内质网应激、增加其数量和改善其结构的功能和作用。易善复可以增加膜稳定性，修复膜功能抗脂质过氧化的作用，临床常用于治疗非酒精性脂肪性肝病。本研究发现，易善复组大鼠脂滴数量较模型组减少，线粒体数量较模型组明显增多，大部分线粒体结构完整，双层膜清晰，线粒体嵴排列整齐，少数线粒体膜结构破坏。提示在使用化痰祛湿活血方同时可以结合现代药理研究增加有修复生物膜作用的药物，以提高疗效。
综上所述，本研究从亚细胞水平观察了化痰祛湿活血方对肝细胞超微结构的影响，为中医药防治NASH的机制研究提供了实验依据。后续还会开展针对线粒体损害导致的细胞程序性死亡方面探究化痰祛湿活血方的作用靶点，为该方的临床使用提供更多实验证据。
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注：a，空白组大鼠肝细胞形态正常(×5000)，箭头为脂滴；b，放大倍数后可见清晰完整线粒体及大量内质网(×50 000)，箭头为线粒体。
图 1 电镜下空白组大鼠肝细胞超微结构
Figure 1. Ultrastructure of liver cells in blank group under electron microscope
注：a, 模型组大鼠肝细胞内大量脂滴积累(×2500)，箭头为脂滴; b, 放大倍数后可见线粒体结构破坏、内质网数量减少(×50 000)，箭头为线粒体。
图 2 电镜下模型组大鼠肝细胞超微结构
Figure 2. Ultrastructure of rat liver cells in model group under electron microscope
注：a，中药组大鼠肝细胞内脂滴明显减少(×2500)；b，放大倍数后可见线粒体膜较完整(×50 000)，箭头为线粒体。
图 3 电镜下中药组大鼠肝细胞超微结构
Figure 3. Ultrastructure of rat liver cells in Chinese medicine group under electron microscope
注：a, 对照组大鼠肝细胞内脂滴减少(×2500)，箭头为脂滴; b，放大倍数后可见线粒体结构较完整(×50 000)，箭头为线粒体。
图 4 电镜下易善复组肝细胞超微结构
Figure 4. Ultrastructure of Essentiale control liver cells under electron microscope
表 1 各组大鼠脂滴和线粒体体密度比较
Table 1. Lipid droplet and mitochondrial body density were compared in each group
组别 例数 脂滴体密度 线粒体体密度 空白组 30 0.12 ±0.10 49.76±2.19 模型组 30 42.11 ±2.341) 20.84±5.011) 易善复组 30 13.74 ±9.722) 32.18±2.922) 中药组 30 1.55 ±0.902)3) 34.02±2.962)3) F值 451.4 360.0 P值 ＜0.000 1 ＜0.000 1 注：与空白组相比，1)P＜0.01；与模型组相比，2)P＜0.01；与易善复组相比，3)P＜0.05。 
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