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TXNRD1在肝细胞癌中活性氧相关细胞凋亡导致多药耐药性中的作用
DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.02.022
Role of thioredoxin reductase 1 in multidrug resistance caused by reactive oxygen species-related cell apoptosis in hepatocellular carcinoma
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摘要:
目的 耐药性是肝细胞癌(HCC)化疗失败的主要原因，硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)作为活性氧(ROS)代谢的主要影响因素，已被证明与HCC患者的不良预后有关。本研究探究TXNRD1在HCC多药耐药机制中的作用。 方法 选取BEL-7402细胞系的BEL/FU细胞作为多重耐药细胞株。siRNA用来干预细胞TXNRD1的表达；实时定量PCR和蛋白质印迹检测TXNRD1的表达；CCK-8法检测和流式细胞术检测用来评估TXNRD1对肝癌细胞ROS蓄积、5-氟尿嘧啶(5-Fu)和多柔比星(DOX)耐药性以及体外凋亡的影响；异种肿瘤移植模型的构建用来研究金诺芬(AUR)在体内对细胞耐药性的影响。计量资料两组间比较采用独立样本t检验。 结果 BEL/FU作为多重耐药HCC细胞系表现出TXNRD1 mRNA与蛋白水平的高表达(P值均＜0.05)。AUR作为TXNRD1的抑制剂，联合化疗药物5-FU及DOX处理与单一化疗药物处理相比，细胞克隆集落形成数目明显减少(P值均＜0.01)，凋亡比例明显增加(P值均＜0.001)。N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为ROS的清除剂，可以明显削弱siRNA敲低TXNRD1表达对BEL/FU细胞耐药性的影响，应用NAC可以有效降低干扰后细胞的凋亡比例(P值均＜0.001)。动物实验也证实，5-Fu与AUR联合治疗相对于单一5-Fu治疗，裸鼠的肿瘤质量更轻(P＜0.001)，体积更小(P＜0.001)。 结论 TXNRD1在HCC耐药中扮演重要角色，抑制其在细胞水平作用可有效改善耐药性，AUR作为TXNRD1抑制剂在HCC综合治疗中也具备极大的应用前景。 Abstract:Objective Drug resistance is the main cause of chemotherapy failure in hepatocellular carcinoma (HCC), and thioredoxin reductase 1 (TXNRD1), as a major influencing factor for reactive oxygen species (ROS) metabolism, has been proven to be associated with the poor prognosis of patients with HCC. This study aims to explore the role of TXNRD1 in the mechanism of multidrug resistance in HCC. Methods BEL/FU cells in BEL-7402 cell line were selected as the multidrug-resistant cell line. The siRNA was used for the intervention of TXNRD1 expression; quantitative real-time PCR and Western blotting were used to measure the expression of TXNRD1; CCK-8 assay and flow cytometry were used to evaluate the effect of TXNRD1 on hepatocyte ROS accumulation, resistance to 5-fluorouracil (5-Fu) and doxorubicin (DOX), and apoptosis in vitro; a xenograft tumor model was established to investigate the effect of auranofin (AUR) on drug resistance in vivo. The two-independent-samples t test was used for comparison of continuous data between two groups. Results As a multidrug-resistant HCC cell line, BEL/Fu showed high mRNA and protein expression levels of TXNRD1 (both P < 0.05). Compared with 5-Fu or DOX treatment alone, the TXNRD1 inhibitor AUR combined with 5-Fu or DOX had had a significant reduction in the number of colony formation (P < 0.01) and a significant increase in apoptosis ratio (P < 0.001). The ROS scavenger N-acetylcysteine (NAC) significantly weakened the effect of TXNRD1 knockdown by siRNA on the drug resistance of BEL/Fu cells, and the application of NAC effectively reduced the apoptosis ratio of cells after siRNA interference (P < 0.001). Animal experiments also confirmed that compared with the nude mice treated with 5-Fu alone, the nude mice treated with 5-Fu and AUR had a significantly lower tumor mass (P < 0.001) and a significantly smaller tumor volume (P < 0.001). Conclusion TXNRD1 plays an important role in the drug resistance of HCC, and inhibition of its level in cells can effectively improve drug resistance. As a TXNRD1 inhibitor, AUR has great application prospects in the multimodality therapy for HCC. -
肝细胞癌(HCC)在世界各地有着很高的发病率和死亡率，特别是在亚洲、非洲和南欧。目前，HCC已经成为全球第五大常见癌症和第三大癌症死亡原因[1]。在我国，HCC的发病率和死亡率分别排在第四位和第二位，且HCC患者预后在临床上仍不尽如人意[2]。对于那些无法手术的患者而言，化学药物治疗的效果常受到药物耐药性的限制，特别是多重耐药性(multi-drug resistance，MDR)[3]。
MDR的发生和发展是一个涉及多种因素的极其复杂的过程。先前研究[4]证实上皮/间质转化、ABC转运蛋白家族的表达、DNA损伤修复和药物外排蛋白的过度表达都与MDR密切相关。代谢扭曲和过度复制引起的过度氧化应激是癌细胞的共同特征[5]。目前，代谢重编程也被认为是癌症的标志。细胞信号通路的异常激活使癌细胞面临更大的氧化应激压力。随着细胞活性氧(ROS)蓄积，癌细胞只有增加抗氧化能力，才能对抗ROS诱导的细胞调亡[6]。硫氧还蛋白(TXN)、硫氧还蛋白还原酶(TXNRD)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)构成细胞内硫氧还蛋白系统(Trx)，该系统对还原-氧化(氧化还原) 稳态至关重要。TXNRD是一种含硒酶和NADPH依赖性黄素蛋白，可将氧化的TXN还原为其二硫醇形式以维持细胞氧化还原稳态[7]。NF-E2相关因子2 (Nrf2) 是一种重要的核转录因子，通过Nrf2/ARE通路调节包括TXNRD1在内的众多细胞保护基因的表达[8]。有趣的是，在各种实体癌如HCC[9]、结肠直肠癌[10]、前列腺癌[11]中, Trx常常被激活并且TXNRD1过表达。此外，TXNRD1可以作为HCC患者的预后因素[12]。
相关临床研究[13]也证实，癌细胞清除ROS的能力是癌症患者预后的指标之一。临床样本TXNRD1表达的增加与晚期临床分期和较差的患者存活率呈正相关。化疗药物通过破坏靶细胞中的氧化还原稳态，进一步导致细胞死亡以达到治疗效果。可以推测TXNRD1表达高的病例更有可能对化疗药物产生抗药性。TXNRD1抑制剂——金诺芬(AUR)，由于其众所周知的安全毒性特征，该化合物被批准用于治疗类风湿关节炎。目前，AUR对于其他疾病(包括癌症、神经退行性疾病)的潜在治疗价值也在探索中[14]。
本研究拟通过siRNA敲低或AUR药物抑制TXNRD1的活性，探究TXNRD1在药物耐药性中发挥的作用，并通过N-乙酰半胱氨酸(NAC)进行ROS耗竭来探索ROS介导耐药性的可能机制。
1. 材料与方法
1.1 细胞系和转染
人HCC细胞系BEL/FU和亲本细胞系BEL-7402购买于KeyGen Biotech Co., Ltd.(中国南京)。BEL/FU细胞和BEL-7402细胞在含有10% FBS(BI, 以色列)的RPMI-1640(BI，以色列)培养基中于5% CO2和37 ℃下培养。在具有50%细胞密度的6孔板中进行转染。Lipofectamine 3000试剂(Thermo Scientific，美国)和Opti-MEM根据制造商的说明使用siRNA转染细胞。TXNRD1si-1上游引物：GCAAGACUCUGAAAUUUTT；TXNRD1si-1下游引物：AUAAUUUCGAGAGUCUUGCTT；TXNRD1si-2上游引物：GGA AGAACAUGGCAUCAAGUUTT；TXNRD1si-2下游引物：AACUUGAUGCCAUGUUCUUCCTT。然后，收集细胞用于基因表达测定。
1.2 集落形成试验
通过在6孔板中接种BEL/FU细胞进行集落形成试验。用5-氟尿嘧啶(5-Fu)、多柔比星(DOX)和AUR处理48 h后，将细胞在新鲜培养基中培养14 d。然后，将菌落用结晶紫染色进行计数。
1.3 药物细胞毒性和细胞增殖试验
化疗药物的细胞毒性由CCK-8法测定，计算药物半抑制浓度(IC50值)，观察药物的细胞毒性。为了评估细胞增殖，将BEL/FU细胞(2×103个/孔)置于96孔板中，并在0、24、48、72和96 h通过CCK-8试剂(DOJINDO Laboratories，日本)检测，操作依据试剂的操作说明。
1.4 蛋白质印迹
RIPA缓冲液(Thermo Scientific，美国)和BCA蛋白质检测试剂盒(Thermo Scientific，美国)用于检测蛋白质浓度。将30 μg蛋白质加载到4%~20% SDS-PAGE(Life Technology，USA)上进行分离，然后转移到0.2 μm PVDF膜(Millipore，USA)上，5%脱脂牛奶封闭2 h后，将膜与适当的一抗(1∶ 1000) 在4 ℃下孵育过夜。随后，将条带洗涤并与相应的HRP偶联二抗(1∶ 5000) 一起孵育。通过EZ-ECL(Biological Industries, 以色列) 检测蛋白质表达。使用Image Lab软件分析条带密度以量化蛋白质量。
1.5 ROS检测
收获细胞并用PBS洗涤。然后，将细胞重新悬浮在PBS中，并与2 μL CellROX Green Reagent(Thermo Scientific，美国)共孵育30 min。通过流式细胞术测量细胞内ROS水平，结果以荧光强度表示。
1.6 RNA分离和实时定量PCR(RT-PCR)
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞系中提取总RNA。PrimeScript RT-PCR试剂盒(TaKaRa Biotechnology，中国)用于逆转录。SYBR Green PCR试剂(TaKaRa)用于使用Bio-Rad PCR仪器(CA，美国)进行RT-PCR。所用引物见表 1。
表 1 引物序列基因名 引物 序列(5′→ 3′) TXNRD1 正向 ATGGTGCTTGTGGCCTTTCT 反向 GCCCACAACACGTTCATTGTC TXNRD2 正向 GGCTTCGACCAGCAAATGTC 反向 CACAGGACGGTGTCAAAGGT TXNRD3 正向 GCTCCTTCAGGAAGATTTGGC 反向 GGGACAACAAAGTCTAGCACCA GAPDH 正向 GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT 反向 GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG 1.7 异种肿瘤移植模型测定
为了探究TXNRD1在体内耐药机制中发挥的作用，从杭州子源实验动物科技有限公司购买了4周大的免疫缺陷裸鼠[许可证：SCXK(浙)2019-0004]构建了异种肿瘤移植模型。将5×106个BEL/FU细胞皮下接种到每只小鼠的右胁腹中。接种3 d后，小鼠接受药物治疗。肿瘤体积的计算公式为：体积=(长×宽×宽)/2。当肿瘤体积大于2000 mm3或者达到观察终点时，处死小鼠。
1.8 伦理学审查
研究中的所有动物实验程序均获得浙江大学医学院第一附属医院实验动物伦理委员会的批准，批号：(2020)实动快审第(7-1)号。
1.9 统计学方法
使用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 TXNRD1在HCC组织和多重耐药细胞系BEL/FU中的表达情况
通过癌症基因组图谱(TCGA)数据集分析证实TXNRD1在癌组织中高表达，与正常肝组织相比，HCC组织中TXNRD1的mRNA水平显著上调(P＜0.001)(图 1a)。病理分级Ⅲ、Ⅳ级患者的TXNRD1表达水平高于病理分级Ⅰ、Ⅱ级的患者(P=0.006)(图 1b)。与正常细胞系LO2相比，HCC细胞系的TXNRD1在mRNA水平均明显上调(P值均＜0.01)(图 1c)，蛋白表达水平与mRNA表达趋势一致(P值均＜0.05)(图 1e)。BEL/FU细胞系和BEL-7402细胞系中5-Fu和DOX的IC50值具有明显差异(P值均＜0.001)(图 1f、g)。BEL/FU细胞中的TXNRD1较亲本BEL-7402细胞在mRNA水平上调(P=0.004)(图 1d)，蛋白表达水平与mRNA表达趋势一致(P＜0.05)(图 1h)。蛋白免疫印迹结果显示，BEL/FU细胞系中的Nrf2水平较亲本BEL-7402细胞系在胞质蛋白中无明显差异(P=0.693)，而胞核蛋白中水平较高(P＜0.05)(图 1i)。
图 1 TXNRD1在HCC组织和细胞系中的表达注：a，正常肝组织和HCC组织中TXNRD1的mRNA水平(TCGA数据集)；b，不同病理分级患者的TXNRD1表达水平；c，正常肝细胞LO2和HCC细胞中TXNRD1的mRNA水平；d，BEL/FU和BEL-7402细胞系中TXNRD1的mRNA水平；e，HCC细胞系和LO2中TXNRD1的蛋白质水平；f、g，BEL/FU和BEL-7402细胞系中5-Fu、DOX的IC50值；h，BEL/FU和BEL-7402细胞系中TXNRD 1的蛋白水平；i，BEL/FU和BEL-7402细胞系中的Nrf2表达水平。CP，细胞质蛋白，NP, 核蛋白。2.2 TXNRD1抑制使BEL/FU细胞对5-Fu和DOX敏感
为了探究TXRND1的功能，利用siRNA沉默TXNRD1在BEL/FU细胞中的表达。在设计的siRNA中，TXNRD1-1 (si-1#) 和TXNRD1-2 (si-2#) 在抑制TXNRD1表达方面最有效，且可特异性敲低TXNRD1的mRNA水平(P值均＜0.001)，而不影响TXNRD2和TXNRD3的mRNA水平(P值均＞0.05)(图 2a)。对不同细胞系中TXNRD1蛋白的表达进行检测，结果也证实了si-1#和si-2#明显抑制了TXNRD1蛋白的表达(P值均＜0.05)(图 2b)。si-1#和si-2#细胞在5-Fu (1000 μmol/mL)和DOX(5 μmol/mL)干预下，细胞活力显著低于si-Ctrl(P值均＜0.05)(图 2c、d)。在5-Fu (1000 μmol/mL)和DOX(5 μmol/mL)的处理下，si-1#和si-2# 细胞克隆形成均较si-Ctrl明显减少(DOX：P值均＜0.001；5-Fu：P值分别为0.043、0.015)(图 2e)。
图 2 siRNA敲低TXNRD1恢复了BEL/FU细胞的药物敏感性注：a，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#中TXNRD1、TXNRD2、TXNRD3的mRNA水平；b，BEL/FU细胞系未处理组、si-Ctrl、si-1#、si-2#中TXNRD1的蛋白质水平；c、d，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#应用DOX、5-Fu药物后的OD450 nm吸光度曲线；e，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#应用DOX、5-Fu药物后的细胞克隆集落形成。2.3 siRNA敲低TXNRD1通过破坏细胞内氧化还原稳态重塑药物敏感性
ROS抑制剂NAC是常用的ROS清除剂。经体外流式细胞术检测，si-1#和si-2#细胞的ROS水平较si-Ctrl明显升高(P值均＜0.001)，经过NAC (0.5 mmol/L)处理24 h后，细胞的ROS水平均有所下降(P值均＜0.001)(图 3a)。当BEL/FU细胞中的TXNRD1被si-1#和si-2#敲低时，经5-Fu(1000 μmol/mL)作用24 h后，细胞凋亡比例明显增加(P值均＜0.001)；同期进行NAC(0.5 mmol/L)干预，可以降低BEL/FU细胞凋亡比例(P值均＜0.001)(图 3b)。经DOX (5 μmol/mL)作用24 h后，细胞凋亡比例明显增加(P值均＜0.001)；同期进行NAC(0.5 mmol/L)干预，可以降低BEL/FU细胞凋亡比例(P值均＜0.001)(图 3c)。蛋白免疫印迹结果证实，si-Ctrl细胞内Caspase-3、Survivin蛋白的表达水平及Bcl-2 /Bax比率均较BEL/7402细胞、si-1#和si-2#细胞升高(P值均＜0.05)(图 4)。
图 3 siRNA抑制TXNRD1导致ROS诱导的细胞凋亡注：a，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#、si-1#+NAC、si-2#+NAC细胞内ROS含量；b，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#应用5-Fu或5-Fu联合NAC后细胞凋亡比例；c，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#应用DOX或DOX联合NAC后细胞凋亡比例。2.4 AUR是BEL/FU细胞的有效药物增敏剂
AUR对TXNRD1具有抑制作用。BEL/FU细胞和BEL- 7402细胞对AUR的药物敏感性(IC50值)差异无统计学意义(P=0.153)(图 5a)。经AUR (0.3 μmol/L) 处理后BEL/FU细胞系中5-Fu与DOX的IC50值明显下降(P值均＜0.01)(图 5b、c)。BEL/FU细胞在AUR(0.3 μmol/L)与5-Fu(1000 μmol/mL) 不同分组处理条件下细胞活力变化如图所示(图 5d)。在AUR(0.3 μmol/L)联合DOX(5 μmol/mL)处理组细胞克隆形成较DMSO、DOX(5 μmol/ml)组明显减少(P值均＜0.001)(图 5e)；在AUR(0.3 μmol/L)联合5-Fu (1000 μmol/mL)处理组细胞克隆形成较DMSO、5-Fu组(1000 μmol/mL)明显减少(P值均＜0.001)(图 5f)。相同浓度下BEL /FU细胞经AUR联合5-Fu处理后细胞凋亡比例较5-Fu处理组明显升高(P＜0.001)，AUR联合DOX较DOX处理组也明显升高(P＜0.001)(图 6、7)。
图 5 AUR抑制TXNRD1可克服BEL/FU细胞的多药耐药性注：a，BEL/7402、BEL/FU细胞系对药物AUR的IC50；b，BEL/FU细胞系在应用AUR前后对5-Fu的IC50；c，BEL/FU细胞系在应用AUR前后对DOX的IC50；d，BEL/FU细胞系在应用DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu药物后的OD450 nm吸光度曲线；e，BEL/FU细胞系在应用DMSO、DMSO+DOX、DMSO+AUR、AUR+DOX药物后的细胞克隆集落形成；f，BEL/FU细胞系在应用DMSO、DMSO+5-Fu、DMSO+AUR、AUR+5-Fu药物后的细胞克隆集落形成。2.5 AUR可有效改善BEL/FU细胞体内5-Fu耐药性
通过将BEL/FU细胞接种在免疫缺陷小鼠的皮下，构建异种移植模型，对AUR的体内治疗效果进行评估。用DMSO、AUR(6 mg·kg-1·d-1，皮下注射)、5-Fu(25 mg·kg-1·d-1，皮下注射)或药物联合处理对接种BEL/FU细胞的异种移植物小鼠进行分组并进行处理观察9 d。不同分组在观察终点的肿瘤大小如图 8a所示，不同分组的肿瘤生长曲线如图 8b所示。观察终点时，AUR处理组与DMAO处理组相比，肿瘤治疗无统计学差异(P=0.063)，AUR联合5-Fu组较单一5-Fu处理组抑制肿瘤生长的能力明显提升(P＜0.001)(图 8c)。观察终点时，AUR联合5-Fu组较单一5-Fu处理组肿瘤质量明显缩小(P＜0.001)(图 8d)。观察期间各组小鼠体质量变化曲线如图 8e所示。
图 8 AUR使BEL/FU细胞对5-Fu处理更敏感注：a，经DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu处理后，BEL/FU成瘤大体图片；b，经DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu处理后，BEL/FU肿瘤体积变化曲线；c，经5-Fu、AUR+5-Fu处理后，BEL/FU肿瘤观察终点时体积；d，经DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu处理后，BEL/FU肿瘤观察终点时质量；e，经DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu处理后，裸鼠体质量变化曲线。3. 讨论
感染、紫外线、烟草、酒精等外界因素的干扰会导致细胞内ROS水平升高，而这些因素亦是导致癌症的因素。以往的研究[15]表明，癌症的发生、进展、血管生成和转移与ROS密切相关。由于癌细胞的代谢活性增强和信号通路的异常激活，使它们具有比正常细胞更高的基础ROS水平[16]。因此，癌细胞需要更完善和可靠的ROS消耗途径来应对由细胞内较高ROS水平引起的氧化应激，以避免细胞凋亡[17]。更重要的是，传统的抗肿瘤药物和放疗作为经典的抗肿瘤方法会增加癌细胞中的ROS水平。这些干预措施会导致DNA损伤、细胞周期停滞甚至细胞凋亡，但癌细胞强大的抗氧化系统可以保持细胞内氧化还原稳态，因此这些治疗措施难以达到理想的效果。
5-Fu与DOX作为临床化疗药物的常见选择，耐药现象的出现往往使化疗不能取得理想的治疗效果。笔者先前的研究[18-19]也证实，源自BEL-7402细胞系的BEL/FU细胞对5-Fu和DOX具有稳定的耐药性，为了研究耐药相关的分子机制，笔者选取了实验室保存的肝癌细胞BEL-7402的5-Fu与DOX多重耐药株BEL/FU细胞，并发现TXNRD1在BEL/FU细胞中表达升高；通过siRNA下调TXNRD1蛋白的表达水平后，BEL/FU细胞对药物5-Fu与DOX的敏感性明显增加。结合先前研究结果，笔者认为在肝癌细胞中TXNRD1表达上调可能通过增强DNA的损伤修复能力从而增加了细胞对药物5-Fu与DOX的耐受性；而TXNRD1的抑制则干扰了dNTPs库，从而干预了DNA的损伤修复，或者通过Bcl-2/Caspase信号通路诱导细胞凋亡，从而增强了细胞对药物的敏感性。
AUR是一种临床上用于治疗风湿性关节炎的药物，能够有效抑制TXNRD1的活性。许多研究表明AUR在癌症治疗中具有良好的耐受性和安全性。单独干预TXNRD1和/或与传统的抗肿瘤方法(药物治疗、放疗等)结合来干扰癌细胞中氧化还原稳态是一个可行的策略。这一发现不仅见于实体瘤，如乳腺癌[20]、肝癌[21]，也见于血液系统肿瘤[22]。本研究结果证实TXNRD1是干预耐药癌细胞氧化还原稳态的合适靶点，这为对化疗药物耐药的患者提供了一个新的选择。TXNRD1表达水平与HCC预后之间的密切关系表明它可作为治疗靶点[23]。此外，癌细胞的基础ROS水平高于正常细胞，使它们更容易受到这种干预。此外，TXNRD1的肝细胞特异性敲除不影响肝脏生长和再生率[24]，即AUR作为TXNRD1抑制剂不影响肝脏正常功能，而是选择性靶向癌细胞。
抗氧化剂广泛存在于食用的各种饮食原材料中。但每天摄入的抗氧化剂如何影响癌症的发病机制仍有待探索。更重要的是，以往关于抗氧化剂摄入量对癌症患者影响的研究结论还需要进一步证实[25]。目前，关于抗氧化剂补充剂与癌症之间关系的大型随机临床试验也产生了相互矛盾的结果[26]。比如补充抗氧化剂如维生素E已被证明会促进前列腺癌的发展，这表明抗氧化剂会增加患癌症的风险[27]。
Trx在癌细胞中调节耐药性的途径有很多，并且相互关联[28]。考虑到肿瘤细胞对药物的反应是一个环境依赖的过程，受微环境、细胞类型和状态等多种因素的调控。需要进一步的研究来证实AUR作为新兴的TXNRD1拮抗剂与恶性肿瘤化疗药物之间的相互作用机制。
综上所述，化疗药物引起的细胞内ROS水平升高会损害癌细胞，耐药细胞中TXNRD1的表达上调缓解了ROS的蓄积压力并维持了细胞内氧化还原稳态，从而阻断与细胞凋亡相关的细胞死亡过程，导致药物耐药性的产生。
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注：a，正常肝组织和HCC组织中TXNRD1的mRNA水平(TCGA数据集)；b，不同病理分级患者的TXNRD1表达水平；c，正常肝细胞LO2和HCC细胞中TXNRD1的mRNA水平；d，BEL/FU和BEL-7402细胞系中TXNRD1的mRNA水平；e，HCC细胞系和LO2中TXNRD1的蛋白质水平；f、g，BEL/FU和BEL-7402细胞系中5-Fu、DOX的IC50值；h，BEL/FU和BEL-7402细胞系中TXNRD 1的蛋白水平；i，BEL/FU和BEL-7402细胞系中的Nrf2表达水平。CP，细胞质蛋白，NP, 核蛋白。
图 1 TXNRD1在HCC组织和细胞系中的表达
注：a，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#中TXNRD1、TXNRD2、TXNRD3的mRNA水平；b，BEL/FU细胞系未处理组、si-Ctrl、si-1#、si-2#中TXNRD1的蛋白质水平；c、d，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#应用DOX、5-Fu药物后的OD450 nm吸光度曲线；e，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#应用DOX、5-Fu药物后的细胞克隆集落形成。
图 2 siRNA敲低TXNRD1恢复了BEL/FU细胞的药物敏感性
注：a，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#、si-1#+NAC、si-2#+NAC细胞内ROS含量；b，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#应用5-Fu或5-Fu联合NAC后细胞凋亡比例；c，BEL/FU细胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#应用DOX或DOX联合NAC后细胞凋亡比例。
图 3 siRNA抑制TXNRD1导致ROS诱导的细胞凋亡
注：a，BEL/7402、BEL/FU细胞系对药物AUR的IC50；b，BEL/FU细胞系在应用AUR前后对5-Fu的IC50；c，BEL/FU细胞系在应用AUR前后对DOX的IC50；d，BEL/FU细胞系在应用DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu药物后的OD450 nm吸光度曲线；e，BEL/FU细胞系在应用DMSO、DMSO+DOX、DMSO+AUR、AUR+DOX药物后的细胞克隆集落形成；f，BEL/FU细胞系在应用DMSO、DMSO+5-Fu、DMSO+AUR、AUR+5-Fu药物后的细胞克隆集落形成。
图 5 AUR抑制TXNRD1可克服BEL/FU细胞的多药耐药性
注：a，经DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu处理后，BEL/FU成瘤大体图片；b，经DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu处理后，BEL/FU肿瘤体积变化曲线；c，经5-Fu、AUR+5-Fu处理后，BEL/FU肿瘤观察终点时体积；d，经DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu处理后，BEL/FU肿瘤观察终点时质量；e，经DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu处理后，裸鼠体质量变化曲线。
图 8 AUR使BEL/FU细胞对5-Fu处理更敏感
表 1 引物序列
基因名 引物 序列(5′→ 3′) TXNRD1 正向 ATGGTGCTTGTGGCCTTTCT 反向 GCCCACAACACGTTCATTGTC TXNRD2 正向 GGCTTCGACCAGCAAATGTC 反向 CACAGGACGGTGTCAAAGGT TXNRD3 正向 GCTCCTTCAGGAAGATTTGGC 反向 GGGACAACAAAGTCTAGCACCA GAPDH 正向 GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT 反向 GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG 
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