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下瘀血汤抑制胶质细胞源性神经营养因子抗肝纤维化的作用机制

张玮 杨广越 沈东晓 马文婷 陶乐 吴柳 严萍 刘成

张玮, 杨广越, 沈东晓, 等. 下瘀血汤抑制胶质细胞源性神经营养因子抗肝纤维化的作用机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2021, 37(3): 575-581. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.03.015
引用本文: 张玮, 杨广越, 沈东晓, 等. 下瘀血汤抑制胶质细胞源性神经营养因子抗肝纤维化的作用机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2021, 37(3): 575-581. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.03.015
ZHANG W, YANG GY, SHEN DX, et al. Mechanism of action of Xiayuxue decoction in inhibiting liver fibrosis by regulating glial cell line-derived neurotrophic factor[J]. J Clin Hepatol, 2021, 37(3): 575-581. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.03.015
Citation: ZHANG W, YANG GY, SHEN DX, et al. Mechanism of action of Xiayuxue decoction in inhibiting liver fibrosis by regulating glial cell line-derived neurotrophic factor[J]. J Clin Hepatol, 2021, 37(3): 575-581. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.03.015

下瘀血汤抑制胶质细胞源性神经营养因子抗肝纤维化的作用机制

DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.03.015
基金项目: 

国家自然科学基金 81673788

国家自然科学基金 81873136

国家自然科学基金 81803232

国家自然科学基金 81803898

国家自然科学基金 82004106

上海市自然科学基金 20ZR1450300

上海市普陀区自主创新项目 ptkwws201817

上海市普陀区自主创新项目 ptkwws201904

上海市卫生健康委员会卫生行业临床研究专项 202040149

详细信息
    作者简介:

    张玮(1994—),女,主要从事肝脏病理学相关基础研究

    通讯作者:

    严萍,seasea66@163.com

    刘成,liucheng0082010@163.com

  • 利益冲突声明:本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突,特此声明.
  • 作者贡献声明:张玮负责课题设计,资料分析,撰写论文;杨广越、沈东晓、严萍负责分子生物学相关实验及动物实验;马文婷、陶乐、吴柳参与收集数据,修改论文;刘成负责拟定写作思路,指导撰写文章并最后定稿.
  • 中图分类号: R575.2

Mechanism of action of Xiayuxue decoction in inhibiting liver fibrosis by regulating glial cell line-derived neurotrophic factor

  • 摘要:   目的  探讨下瘀血汤是否通过抑制胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)发挥抗肝纤维化的作用。  方法  24只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、下瘀血汤组,每组各8只。模型组和下瘀血汤小鼠腹腔注射10% CCl4,第4周开始下瘀血汤组小鼠给予0.467 8 g/kg下瘀血汤灌胃。检测肝功能指标ALT、AST水平,观测肝脏组织病理形态学。免疫组化检测平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及GDNF蛋白表达。GDNF(10 ng/ml)处理GFP-Col-HSC和人原代肝星状细胞(HSC),检测HSC活化。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。  结果  模型组ALT和AST水平较对照组显著升高,下瘀血汤组ALT和AST水平较模型组显著降低(P值均<0.01)。肝组织病理学显示,模型组炎症细胞浸润明显,增生的胶原纤维形成纤维间隔,下瘀血汤组胶原纤维间隔较疏松及炎症细胞浸润减轻。免疫组化显示,与对照组相比,模型组α-SMA及GDNF阳性表达显著升高(P值均<0.01),均分布在纤维间隔,下瘀血汤组α-SMA与GDNF表达较模型组均显著降低(P值均<0.05)。免疫印迹结果显示,对照小鼠肝组织GDNF表达比较低,CCl4造模6周肝纤维化形成,GDNF表达上调10倍左右,下瘀血汤显著抑制模型小鼠GDNF蛋白表达(P值均<0.01);α-SMA和Ⅰ型胶原α1(Col1)表达在肝纤维化模型小鼠显著上调,下瘀血汤处理后α-SMA与Col1显著下降(P值均<0.01)。体外结果显示,GDNF可诱导HSC细胞α-SMA及Ⅰ型胶原α1蛋白表达显著上调,而下瘀血汤对此有显著抑制作用(P值均<0.01)。  结论  肝纤维化形成中GDNF表达显著上调,GDNF可诱导HSC活化,下瘀血汤可抑制GDNF从而抗肝纤维化。
  • 图  1  肝组织HE染色和天狼星红染色(×100)

    注:a~c,肝组织HE染色;d~f,天狼星红染色。

    图  2  α-SMA及GDNF在CCl4诱导肝纤维化中的表达

    注:α-SMA免疫组化染色(×100),下面是上图方框内的放大(×400);GDNF免疫组化染色(×100),下面是上图方框内的放大(×400)。

    图  3  α-SMA及GDNF在CCl4诱导肝纤维化中的免疫印迹(n=4)

    图  4  下瘀血汤对GDNF诱导的HSC活化的抑制作用

    注:a,人原代HSC细胞在GDNF(10 ng/ml)浓度下处理2 h; b, 免疫印迹检测α-SMA和Col1表达及半定量结果;c, GDNF处理GFP-Col-HSC细胞48 h,检测荧光。

    表  1  引物序列表

    基因 上游 下游
    18S rRNA 5′-AGTCCCTGCCCTTTGTACACA-3′ 5′-CGATCCGAGGGCCTCACTA-3′
    Col4 A2 5′-TTATGCACTGCCTAAAGAGGAGC-3′ 5′-CCCTTAACTCCGTAGAAACCAAG-3′
    Col5 A1 5′-GCCCGGATGTCGCTTACAG-3′ 5′-AAATGCAGACGCAGGGTACAG-3′
    Col5 A2 5′-GACTGTGCCGACCCTGTAAC-3′ 5′-CCTGGACGACCACGTATGC-3′
      注: Col,Ⅰ型胶原α。
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    表  2  各组小鼠血清转氨酶水平

    组别 动物数(只) ALT(U/L) AST(U/L)
    对照组 8 26.51±5.70 19.07±6.22
    模型组 8 141.79±39.861) 62.74±14.881)
    下瘀血汤组 8 70.84±15.382) 29.48±7.252)
    F 43.69 31.46
    P <0.001 <0.001
      注:与对照组比较, 1)P<0.001;与模型组比较, 2)P<0.01。
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    表  3  各组小鼠炎性浸润半定量及天狼星红阳性半定量结果

    组别 动物数(只) 炎症细胞阳性面积(%) 天狼星红阳性面积(%)
    对照组 8 0.94±0.09 0.73±0.07
    模型组 8 5.55±0.521) 3.98±0.371)
    下瘀血汤组 8 1.74±0.162) 1.82±0.172)
    F 120.40 95.30
    P 0.001 4 0.001 9
      注:与对照组比较, 1)P<0.01;与模型组比较, 2)P<0.01。
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    表  4  各组小鼠肝脏组织中α-SMA及GDNF含量半定量分析

    组别 动物数(只) α-SMA阳性面积(%) GDNF阳性面积(%)
    对照组 8 0.22±0.02 0.06±0.01
    模型组 8 1.96±0.181) 1.66±0.151)
    下瘀血汤组 8 0.90±0.082) 0.66±0.062)
    F 111.50 141.60
    P 0.001 5 0.001 1
      注:与对照组比较, 1)P<0.01;与模型组比较, 2)P<0.05。
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    表  5  各组小鼠肝脏组织中α-SMA及GDNF含量灰度值半定量分析

    组别 动物数(只) GDNF灰度值 α-SMA灰度值 Col1灰度值
    对照组 8 1.00±0.71 1.00±0.17 1.00±0.11
    模型组 8 9.71±0.121) 9.45±0.121) 3.71±0.311)
    下瘀血汤组 8 1.60±0.112) 3.90±0.052) 1.46±0.082)
    F 269.50 2452.00 108.90
    P 0.000 4 <0.000 1 0.001 6
      注:与对照组比较, 1)P<0.01;与模型组比较, 2)P<0.01。
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    表  6  体外实验中炎症因子及纤维化指标灰度值半定量分析

    组别 pNF-κB TNFα α-SMA Col1
    对照组 1.00±0.08 1.00±0.13 1.00±0.27 1.00±0.28
    GDNF组 3.57±0.091) 2.94±0.071) 2.71±0.16 1) 4.89±0.141)
    GDNF+下淤血汤组 1.40±0.032) 1.57±0.042) 1.63±0.192) 2.95±0.212)
    F 733.20 257.00 33.77 157.10
    P <0.000 1 0.000 4 0.008 8 0.000 9
      注:与对照组比较, 1)P<0.01;与GDNF组比较, 2)P<0.01。
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    表  7  体外实验中纤维化相关因子mRNA相对表达量比较

    组别 Col4 A2 Col5 A1 Col5 A2
    对照组 1.00±0.01 1.00±0.07 1.00±0.01
    GDNF组 5.02±1.391) 4.10±0.491) 3.19±0.191)
    GDNF+下瘀血汤组 2.71±0.242) 1.46±0.352) 1.79±0.352)
    F 12.24 45.63 46.57
    P 0.036 1 0.005 7 0.005 5
      注:与对照组比较, 1)P<0.05;与GDNF组比较, 2)P<0.05。
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-09-11
  • 修回日期:  2020-11-05
  • 刊出日期:  2021-03-16
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