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肝爽颗粒浸膏减轻对乙酰氨基酚所致肝细胞损伤的作用机制

吴桥 余朋飞 毕研贞 王宝增 王子璇 李志杰 陈煜 段钟平

吴桥, 余朋飞, 毕研贞, 等. 肝爽颗粒浸膏减轻对乙酰氨基酚所致肝细胞损伤的作用机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2021, 37(1): 120-125. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.01.024
引用本文: 吴桥, 余朋飞, 毕研贞, 等. 肝爽颗粒浸膏减轻对乙酰氨基酚所致肝细胞损伤的作用机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2021, 37(1): 120-125. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.01.024
WU Q, YU PF, BI YZ, et al. Mechanism of Ganshuang granule extract in alleviating N-acetyl-p-aminophenol-induced hepatocellular injury [J]. J Clin Hepatol, 2021, 37(1): 120-125. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.01.024
Citation: WU Q, YU PF, BI YZ, et al. Mechanism of Ganshuang granule extract in alleviating N-acetyl-p-aminophenol-induced hepatocellular injury [J]. J Clin Hepatol, 2021, 37(1): 120-125. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.01.024

肝爽颗粒浸膏减轻对乙酰氨基酚所致肝细胞损伤的作用机制

DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.01.024
基金项目: 

国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治” 2012ZX10002004-006

国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治” 2017ZX10203201-005

国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治” 2017ZX10201201-001-001

国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治” 2017ZX10201201-002-002

国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治” 2017ZX10201201-004-002

国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治” 2017ZX10202203-006-001

国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治” 2017ZX10302201-004-002

北京市医院管理局“登峰”人才培养计划基金项目 DFL20151601

北京市医院管理局临床医学发展专项 ZYLX201806

详细信息
    作者简介:

    吴桥(1989—),女,医学博士,主要从事肝病及感染性疾病研究

    余朋飞(1992—),男,主要从事肝病研究

    通讯作者:

    陈煜,chybeyond@163.com

    段钟平,duan2517@163.com

  • 利益冲突声明:本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突,特此声明。
  • 作者贡献声明:吴桥负责课题设计,资料分析,撰写论文; 余朋飞负责细胞实验、指标检测; 毕研贞负责高内涵检测及ROS数据的采集; 王宝增、王子璇、李志杰参与收集数据,修改论文; 陈煜、段钟平负责拟定写作思路,指导撰写文章并最后定稿。
  • 二者对本文贡献相同,同为第一作者
  • 中图分类号: R575

Mechanism of Ganshuang granule extract in alleviating N-acetyl-p-aminophenol-induced hepatocellular injury

  • 摘要:   目的  研究肝爽颗粒浸膏减轻对乙酰氨基酚(N-乙酰基-对氨基苯酚,APAP)诱导的肝细胞毒性的能力,以及可能涉及的机制。  方法  设立5组细胞培养组,分别为正常对照组、APAP损伤组、3组不同肝爽颗粒浸膏浓度的损伤保护组。使用20 mmol/L APAP加入细胞培养液孵育24 h构建造体外药物肝损伤模型,损伤保护组提前加用不同浓度肝爽颗粒浸膏(0.2 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml)8 h孵育后加入APAP损伤24 h。检测不同组别的肝细胞损伤标志物(ALT、AST、LDH)、线粒体损伤标志物(线粒体膜电位、GDH)、抗氧化及氧化应激标志物(GSH、SOD、MDA、ROS)等。进一步针对实验结果进行机制探讨。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。  结果  肝爽颗粒浸膏可以减轻APAP引起的肝细胞毒性,肝爽颗粒浸膏可以提高细胞活力(P<0.001),降低上清中AST、ALT、LDH的含量(P值分别为<0.001、<0.001、<0.05);肝爽颗粒浸膏可以抑制APAP诱导的肝细胞氧化应激,肝爽颗粒浸膏组的氧化应激指标ROS、MDA较APAP组下降(P值均<0.01);肝爽颗粒浸膏可以剂量依赖性减轻APAP诱导的肝细胞线粒体膜电位丢失(P<0.05),降低了上清线粒体损伤标志物GDH的含量(P<0.001);肝爽颗粒浸膏可以抑制CYP2E1/1A2的表达(P值均<0.05);肝爽颗粒浸膏可以增加肝细胞Ⅱ相酶表达; 肝爽颗粒浸膏可以诱导Nrf2及其下游基因NQO-1及GCLC的表达(P值均<0.05)。  结论  肝爽颗粒浸膏可通过两种途径预防APAP诱导肝脏损伤,第一种途径是肝爽颗粒浸膏下调CYP2E1/1A2的表达减少了APAP毒性产物NAPQI的生成; 第二种途径是肝爽颗粒浸膏上调解毒通路的表达,激活Nrf2增加抗氧化酶(SOD、GSH)和Ⅱ相酶的表达,从而加速APAP的无害代谢。
  • 图  1  肝爽浸膏对APAP诱导的线粒体膜电位丢失的影响

    注:高内涵监测不同组别0、3 h后线粒体膜电位TRME强度。

    图  2  肝爽颗粒浸膏对不同组别Ⅱ相酶的影响

    注:与APAP组相比, *P<0.05,**P<0.001。

    图  3  肝爽颗粒浸膏诱导Nrf2表达

    注:Western Blot检测不同组别Nrf2蛋白水平表达结果。

    表  1  引物序列

    引物名称 序列(5′-3′)
    GAPDH F GGACTCATGACCACAGTCCA
    R TCAGCTCAGGGATGACCTTG
    UGT1A1 F CGCCTCTCCAGCCTTCACAAG
    R GTCAGCACGACGGCCAAGAG
    UGT1A3 F GCCAACAGGAAGCCACTATC
    R CAGCAATTGCCATAGCTTTC
    UGT1A6 F CCAGTGCCGTATGACCAAGAAGAG
    R GGAGGCTCTGGCAGTTGATGAAG
    UGT2B7 F GCAGCAGAATACAGCCATTGGATG
    R GCTGAAGATGCCAGTACAGTCACC
    GSTα1 F TCCAGCTTCCCTCTGCTGAA
    R GGCTGCCAGGCTGTAGAAAC
    GSTM1 F GCCTGCTCCTGGAATACACAGAC
    R GCAATGTAGCACAAGATGGCGTTG
    SULT1A1 F TGGTTCAGCACACGTCGTTCAAG
    R CATCTTCTCCGCATAGTCCGCATC
    SULT2A1 F GAGATTCTCTGCCTGATGCACTCC
    R ATCACCTTGGCCTTGGAACTGAAG
    GCLC F ATGGCTTTGAGTGCTGCATCTCC
    R GGCTCCAGTCCTCGCTCCTC
    NQO1 F GTCGGCAGAAGAGCACTGATCG
    R ACTCCACCACCTCCCATCCTTTC
    Nrf2 F ACACGGTCCACAGCTCATCAT
    R TTGGCTTCTGGACTTGGAAC
    CYP2E1 F GCCGACATCCTCTTCCGCAAG
    R CTGTGGCTTCCAGGCAAGTAGTG
    CYP1A2 F CAACACCTTCTCCATCGCCTCTG
    R CCACTGACACCACCACCTGATTG
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    表  2  肝爽浸膏对APAP诱导的HepG2细胞急性损伤的影响

    指标 对照组 APAP组 浸膏0.2 μg/ml组 浸膏1 μg/ml组 浸膏5 μg/ml组 F P
    细胞活力(%) 100.00±3.33 37.53±0.51 40.45±0.58 45.02±0.07 43.69±0.80 1668.01 <0.001
    AST(U/ml) 3.80±0.14 7.80±0.14 7.50±0.42 6.70±0.14 6.90±0.14 97.80 <0.001
    ALT(U/ml) 0.55±0.07 1.55±0.07 1.10±0.14 0.85±0.07 0.70±0.00 43.92 <0.001
    LDH(U/ml) 34.25±5.44 56.70±3.25 38.30±5.66 42.35±1.34 35.90±3.25 9.63 <0.05
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    表  3  肝爽浸膏对APAP诱导的氧化应激指标的影响

    指标 对照组 APAP组 浸膏0.2 μg/ml组 浸膏1 μg/ml组 浸膏5 μg/ml组 F P
    GSH(μmol/g prot) 51.79±9.06 37.14±1.43 47.14±6.23 49.29±4.88 43.21±3.76 3.289 <0.05
    SOD(U/mg prot) 319.74±5.58 245.00±1.77 284.63±0.87 281.25±11.46 281.78±14.68 13.454 <0.05
    ROS(%) 100.00±1.94 277.94±1.41 262.19±1.92 238.47±3.15 231.92±2.80 919.150 <0.001
    MDA(nmol/mg prot) 0.84±0.12 3.70±0.48 1.00±0.12 1.81±0.21 1.08±0.12 66.900 <0.001
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    表  4  肝爽浸膏对APAP诱导的线粒体损伤的影响

    指标 对照组 APAP组 浸膏0.2 μg/ml组 浸膏1 μg/ml组 浸膏5 μg/ml组 F P
    荧光表达 1.38±0.04 0.28±0.03 0.34±0.03 0.59±0.08 0.76±0.11 35.868 <0.05
    GDH(IU/ml) 43.51±0.37 60.66±1.96 56.26±0.45 54.98±0.45 53.37±0.91 89.590 <0.001
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    表  5  肝爽浸膏对不同组别CYP2E1/1A2 mRNA表达水平的影响

    指标 对照组 APAP组 浸膏0.2 μg/ml组 浸膏1 μg/ml组 浸膏5 μg/ml组 F P
    CYP2E1 1.00±0.05 1.89±0.31 0.86±0.07 0.64±0.06 0.70±0.09 32.909 <0.001
    CYP1A2 1.00±0.01 1.13±0.11 0.95±0.09 0.67±0.02 0.58±0.05 22.710 <0.05
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    表  6  肝爽浸膏对Nrf2、GCLC及NQO-1 mRNA水平的影响

    指标 对照组 APAP组 浸膏0.2 μg/ml组 浸膏1 μg/ml组 浸膏5 μg/ml组 F P
    Nrf2 1.00±0.04 0.13±0.01 0.61±0.04 0.75±0.00 0.76±0.15 39.084 <0.05
    NQO-1 1.00±0.08 0.29±0.02 0.46±0.05 0.78±0.06 0.82±0.15 22.456 <0.05
    GCLC 1.00±0.01 0.51±0.09 1.32±0.25 1.29±0.05 1.19±0.18 10.464 <0.05
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-06-05
  • 修回日期:  2020-09-16
  • 刊出日期:  2021-01-18
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