Influencing factors for severe acute pancreatitis with sepsis

肝性脑病（hepatic encephalopathy，HE）是急慢性肝功能障碍的常见并发症，以代谢紊乱和神经精神异常为主要特征。其主要机制以氨中毒学说为主导，与炎症反应损伤协同促进HE的发生发展。研究^［1］表明，轻微型肝性脑病（minimal hepatic encephalopathy，MHE）的发病机制与HE的发病机制无明显差异，只是程度不同。炎症中的炎性细胞因子和氨等有毒物质破坏血脑屏障进入脑组织，导致脑实质改变及脑功能障碍^［2］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通过经活化后的蛋白激酶B（AKT）激活底物哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），起到调控下游细胞增殖和炎症靶基因表达的作用^［3］。研究^［4］发现，PI3K/AKT/mTOR信号通路是机体炎症反应的重要调节途径，能够抑制脑损伤后的神经炎性反应及细胞凋亡，发挥一定的脑组织保护作用。

大黄煎剂是中医药治疗MHE的经验处方，临床与科研应用十余年，卓有成效。本团队研究^［5-6］发现，大黄煎剂保留灌肠后，可以显著改善HE患者的临床症状，降低内毒素水平，减少肠道细菌过度增长，调整肠道菌群失衡，发挥显著的保肝护脑的疗效。近期的网络药理学研究^［7］亦证实，PI3K/AKT信号通路可能是大黄煎剂治疗MHE的作用靶点通路之一。综上，本研究旨在探讨大黄煎剂对MHE大鼠模型学习认知能力的影响及其“通腑开窍”理论的作用机制。

1.   材料与方法

1.1   实验动物与分组

清洁级、雄性成年SD大鼠60只，6～8周龄，体质量200～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证编号：SYXK（湘）2019-0004，实验动物使用许可证：SYXK（桂）2019-0001。

按照完全随机方法取6只大鼠作为空白组（CON组），剩余54只大鼠构建慢性肝硬化模型，经Morris水迷宫实验测试符合MHE症状大鼠40只，造模成功率为76.9%。将40只大鼠采用完全随机方法分为模型组（MOD组）、乳果糖组（LT组）、大黄煎剂低剂量组（RD1组）、大黄煎剂中剂量组（RD2组）及大黄煎剂高剂量组（RD3组），每组8只。

1.2   主要药品与试剂

大黄煎剂：醋大黄30 g，乌梅30 g（天江药业有限公司提供，机配免煎颗粒），CCl₄（麦克林，C13385752），ELISA试剂盒（武汉华美），ALT（X22039295）、AST（X23039296）、IL-1β（Z19031282）、IL-6（Z20031283）、TNF-α（X21039294）、ZOL（200 mL）RNA提取通用（德国MACHEREY-NAGEL，740404），PI3K、AKT、mTOR mRNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RIPA高效裂解液（索莱宝科技，HY-K0022），BCA蛋白定量试剂盒（博士德生物，14J29C46），三鹰生物技术：PI3K（60225-1-Ig）、mTOR（66888-1-Ig），AKT（Cell Signaling，C67E7）。

1.3   仪器

图像采集软件Leica Application Suite V4（德国Leica公司），Mastercycle Nexus PCR循环仪（Eppendoff公司），LightCycler^®480Ⅱ实时荧光定量PCR仪（罗氏公司）。

1.4   实验方法

1.4.1   慢性肝硬化大鼠模型的建立

本实验参考文献^［8］建立慢性肝硬化模型，将CCl₄（分析纯）、橄榄油按2∶3混合后于大鼠皮下注射（最初8次1.5 mL/kg，而后每次2 mL/kg），每隔3 d注射1次，持续12周；CON组注射等量生理盐水。构建慢性肝硬化模型的54只大鼠在造模期间死亡2只，余52只大鼠中随机取3只用以观察造模后大鼠肝功能和血氨水平是否显著升高，肝组织是否符合慢性肝硬化病理改变，方法为尾静脉采血0.25 mL，按照说明书操作，离心15 min（2 000 r/min），提取血清，用ELISA试剂盒检测大鼠血清ALT、AST水平；提取0.2 mL血浆，全自动生化检测仪快速检测大鼠血氨水平；同时，取大鼠肝组织进行HE染色。

1.4.2   MHE判定

慢性肝硬化造模成功后结合Morris水迷宫测试结果判定MHE，符合下列3项条件则可认为MHE模型构建成功：（1）慢性肝硬化大鼠模型的Morris水迷宫测试值大于CON组；（2）在整个实验造模过程中，大鼠未出现显性肝性脑病症状，包括自主活动减弱、反应迟钝、运动失调、昏迷等；（3）血氨水平高于CON组。

1.4.3   干预方法

（1）CON组和MOD组：用生理盐水保留灌肠，2 mL/只，1次/d，持续10 d。（2）LT组：用乳果糖按22.5%剂量保留灌肠，2 mL/只，1次/d，持续10 d。（3）RD1组、RD2组、RD3组：分别用大黄煎剂按2.5、5.0、7.5 g/kg三种剂量保留灌肠，2 mL/只，1次/d，持续10 d。

1.4.4   检测指标

1.4.4.1   Morris水迷宫逃避潜伏期

所有大鼠治疗10 d后，进行Morris水迷宫测试，分析大鼠的空间学习记忆能力。将水池分为1、2、3、4共四个象限，分别让大鼠面向缸壁入水，寻找并记录爬上平台时间（逃避潜伏期），取每一组次的平均值。

1.4.4.2   肝及脑组织HE染色

肝、脑组织于4%多聚甲醛固定24 h后进行包埋、切片及染色。

1.4.4.3   ELISA法检测大鼠动脉血的肝功能和炎性细胞因子的表达

按照说明书操作，提取血清，用ELISA试剂盒检测大鼠血清ALT、AST、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。

1.4.4.4   定量聚合酶链式反应（qPCR）检测大鼠脑组织PI3K、AKT及mTOR的mRNA表达

取20～30 mg脑组织，加入400 μL裂解液研磨2 min后，再加入600 μL裂解液。4 ℃冰箱放置15 min，常温离心机瞬离10 s，加入200 mL氯仿，震荡混匀，室温静置5 min。离心（4 ℃，12 000×g，15 min），吸取上水相0.45～0.50 mL。加入异丙醇0.5 mL，颠倒混匀，离心后的沉淀物即为RNA。加入1 mL的75%乙醇溶液，混匀后离心（4 ℃，12 000×g，10 min），得到白色黏附物。加入75%的乙醇980 μL洗涤3次，晾干加入50 μL无酶水，混匀后备用。

按试剂盒说明书进行反转录（SYBR Green qPCR法），配置qPCR反应体系，随后置入LightCycler^®480Ⅱ仪器中进行检测，反应结束后确认qPCR的溶解曲线和扩增曲线，进行定量、作RNA标准曲线等。其中，目的基因的相对表达量应用2^-ΔΔCt法计算结果。以β-actin作为内参，检测脑组织PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量。引物设计由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表  1  引物序列

Table  1.  Primer sequences

引物名称	引物序列（5′-3′）
β-actin	F：CTAAGGCCAACCGTGAAAAG
	R：ACCAGAGGCATACAGGGACA
PI3K	F：TGCACACATGCTTGCTACCTC
	R：TTGCTTTGACCTGACCCATCT
AKT	F：ATGGACTTCCGGTCAGGTTCA
	R：GCCCTTGCCCAGTAGCTTCA
mTOR	F：GCTTATCAAGCAAGCGACATCTCA
	R：TCCACTGGAAGCACAGACCAAG

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1.4.4.5   蛋白质印迹法（Western Blot）检测大鼠脑组织PI3K、AKT及mTOR的蛋白表达

取30 mg脑组织，加入200 μL RIPA高效裂解液提取组织蛋白，BCA法检测蛋白浓度。后续电泳上样体积为5 μL，蛋白量为30 μg。使用快速凝胶试剂盒配制7.5%电泳凝胶，将样本转移至PVDF膜，TBST洗膜及封闭，一抗4 ℃孵育过夜［抗体稀释比例：β-actin（1∶800），PI3K（1∶2 000），AKT（1∶1 000），mTOR（1∶4 000）］。TBST洗膜，加入对应的二抗（1∶10 000）室温孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL显影液避光反应5 min，显影后计算相对蛋白表达量。

1.5   统计学方法

应用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，Graphpad Prism 7.0软件进行绘图。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   各组大鼠肝功能和血氨水平比较

与CON组相比，MOD组大鼠ALT、AST和血氨水平均显著升高（P值均<0.01）；与MOD组相比，各治疗组大鼠ALT、AST及血氨水平均明显降低（P值均<0.01）。此外，RD3组大鼠的AST水平显著低于RD1组（P<0.01）（图1）。

图  1  各组大鼠肝功能和血氨水平比较

Figure  1.  Comparison of liver function and blood ammonia levels among groups of rats

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2.2   Morris水迷宫测试结果

与CON组相比，MOD组大鼠的逃避潜伏期时间显著增加（P<0.01）；与MOD组相比，各治疗组大鼠的逃避潜伏期时间均明显减少（P值均<0.01）。此外，LT组和RD3组大鼠的逃避潜伏期时间显著少于RD1组（P值均<0.05）（图2）。

图  2  各组大鼠药物干预后的逃避潜伏期比较

Figure  2.  Comparison of escape latency after drug intervention in each group of rats

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2.3   肝组织及脑组织病理观察

2.3.1   肝组织病理

与CON组相比，MOD组大鼠肝组织病理损伤严重，可见多个完整的肝小叶结构破坏，肝细胞大面积变性坏死，结构排列紊乱，细胞核深染，肝索排列不规整，肝窦扩张明显，伴有出血和大量纤维组织增生，假小叶形成。与MOD组相比，各治疗组大鼠的肝组织病理损伤得到改善，小部分肝细胞变性坏死，结构排列紊乱减少，细胞核染色较浅，肝索排列稍不规整，肝窦扩张及出血症状减轻或消失，可见少量纤维组织，其中以LT组和RD3组效果较好（图3）。

注： a，CON组；b，MOD组；c，LT组；d，RD1组；e，RD2组；f，RD3组。

图  3  光镜下各组大鼠肝组织HE染色结果（×200）

Figure  3.  Light microscopy results of HE staining of rat liver tissue in each group （×200）

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2.3.2   脑组织病理

与CON组相比，MOD组大鼠脑皮质与海马区内神经元结构模糊，排列稀疏，形状、大小不规则，数量减少，染色浅，可见较多的神经元变性和核固缩，大量炎症细胞浸润。与MOD组相比，各治疗组大鼠的脑皮质与海马区内神经元改变较轻，形态排列较规则紧密，细胞略微肿胀，形状与大小稍不规则，数量较少，染色较深，可见少量的神经元变性、核固缩及炎症细胞浸润，其中以LT组和RD3组效果较好（图4）。

注： a，CON组；b，MOD组；c，LT组；d，RD1组；e，RD2组；f，RD3组。

图  4  光镜下各组大鼠脑组织HE染色结果（×200）

Figure  4.  Light microscopy results of HE staining of rat brain tissue in each group （×200）

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2.4   各组大鼠血清炎性细胞因子表达水平比较

与CON组相比，MOD组大鼠血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达均明显升高（P值均<0.01）；与MOD组相比，各治疗组大鼠血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达均显著降低（P值均<0.01）。此外，与RD1组相比，LT组的TNF-α水平、RD2组的IL-1β水平以及RD3组的IL-1β和IL-6水平均明显降低（P值均<0.05）（图5）。

图  5  各组大鼠相关炎性细胞因子水平比较

Figure  5.  Comparison of levels of relevant inflammatory cytokines among groups of rats

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2.5   各组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达水平比较

与CON组相比，MOD组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达量均显著升高（P值均<0.01）；与MOD组相比，各治疗组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达量均显著降低（P值均<0.05）。此外，LT组、RD2组和RD3组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达量均明显低于RD1组（P值均<0.05）；RD3组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达量明显低于RD2组（P值均<0.05）（图6）。

图  6  各组大鼠脑组织中PI3K、AKT、mTOR的mRNA相对表达量比较

Figure  6.  Relative mRNA expression of PI3K， AKT and mTOR in the brain tissue of rats in each group

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2.6   各组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR蛋白表达水平比较

与CON组相比，MOD组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达量均显著升高（P值均<0.01）；与MOD组相比，各治疗组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达量均显著降低（P值均<0.01）。此外，LT组、RD2组和RD3组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达量均明显低于RD1组（P值均<0.01）；LT组、RD3组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达量均显著低于RD2组（P值均<0.05）（图7）。

图  7  各组大鼠脑组织中PI3K、AKT、mTOR的蛋白免疫印迹结果及蛋白表达量比较

Figure  7.  Comparison of protein expression of PI3K， AKT， and mTOR in brain tissues of rats from various groups

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3.   讨论

有研究^［9］通过正电子发射型计算机断层显像技术发现，HE患者脑部相关区域的胶质细胞¹¹C-PK11195和¹⁸F-DPA-714结合显著增加，这为HE存在脑神经炎症反应提供了直接的影像学证据。神经炎症级联反应持续存在诱导神经元细胞凋亡，影响神经递质传递，造成星形胶质细胞水肿/脑水肿等脑神经病理改变，这与HE的临床特征性症状重叠^［10］。因此，深入研究脑神经炎症出现的原因及其诱发MHE的机制，将为慢性肝硬化并发MHE的防治提供新的思路及手段。

传统医学并无与HE相对应的病名，根据其临床表现可归属“肝厥”“神昏”等范畴。此病的核心病机是腑气不通，蒙蔽神窍，治法多用通腑开窍，方选大黄煎剂^［5］。大黄煎剂由醋大黄和乌梅两味中药组成，方中醋大黄善泻下凉血、清热解毒，乌梅有涩肠生津止渴之效。二者共奏酸苦涌泄之妙，荡涤肠胃，逐邪外出，增加脑氧供应，以达到通腑开窍之效^［6］。

本研究结果显示，大黄煎剂改善MHE大鼠肝功能主要表现在：与模型组比较，大黄煎剂低、中、高剂量组大鼠肝脏中肝细胞变性坏死、炎性细胞浸润、组织增生程度均得到不同程度改善，ALT、AST水平均显著降低。大黄煎剂改善MHE大鼠脑功能表现在：与模型组比较，大黄煎剂低、中、高剂量组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期时间均明显缩短，血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低，这可能与大黄化学成分及单体化合物具有显著的抗神经炎症，穿透血脑屏障发挥抗炎功能，减轻炎症反应，抑制白三烯B4，减少炎性因子IL-6、TNF-α的释放，下调血小板激活因子，抑制白细胞、促炎因子基因的甲基化等有关^［11-13］。脑组织病理结果显示，大黄煎剂低、中、高剂量脑神经元形态排列紊乱、肿胀坏死、炎症细胞浸润减轻，且脑组织相关PI3K/AKT/mTOR炎症通路的mRNA与蛋白表达水平均显著低于模型组，以大黄煎剂高剂量组效果最佳。有研究^［14-15］表明，多种药物可激活PI3K/AKT/mTOR通路以减轻相关疾病的神经炎症。类似的，本研究结果表明，大黄煎剂可能激活PI3K/AKT/mTOR通路，抑制MHE大鼠脑组织炎症，有效改善脑组织炎性损伤。

综上，大黄煎剂可以降低MHE大鼠脑内炎症反应，改善MHE的神经精神症状，这些保护作用可能通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路进而减少炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α合成及释放来实现。大黄煎剂是含有多种有效成分的中药复方，未来笔者团队将继续探究并筛选出复方中治疗MHE的主要有效成分。