Research advances and challenges in herb-induced liver injury

Chenghai LIU

doi:10.12449/JCH240801

Volume 40 Issue 8

Aug. 2024

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Research advances and challenges in herb-induced liver injury

DOI: 10.12449/JCH240801

Chenghai LIU^{1, 2, 3
,
,
,}

1.
Institute of Liver Diseases，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China
2.
Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine，Shanghai 201203，China
3.
Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases，Ministry of Education，Shanghai 201203，China

Research funding:

Shanghai TCM Development Three-Year Action Plan Project (ZY（2018-2020）-CCCX-5001);

Shanghai Science and Technology Innovation Action Plan Medical Innovation Research Special Project (20Z21900100);

Shanghai Key Specialty of Traditional Chinese Clinical Medicine (shslczdzk01201)

More Information

Corresponding author: LIU Chenghai， chenghailiu@hotmail.com （ORCID： 0000-0002-1696-6008）
Received Date: 2024-06-26
Accepted Date: 2024-07-10
Published Date: 2024-08-25

Abstract

Abstract

Herb-induced liver injury （HILI） shows a high incidence rate and has great impacts on the clinical medication safety of traditional Chinese medicine and the healthy development of the industry. In recent years， the research on HILI has attracted wide attention and made remarkable progress， and related clinical diagnosis and treatment guidelines have been formulated and updated by the academic organizations in China and globally. This article compares the recent guidelines on HILI formulated by different organizations and elaborates on the main achievements in terms of mechanism of toxicity， clinical diagnosis and disease assessment， risk factors， and clinical prevention and treatment， and it also proposes the unmet needs， the research difficulties that need to be taken seriously， and possible prevention and treatment strategies.
- Drugs， Chinese Herbal,
- Chemical and Drug Induced Liver Injury,
- Toxic Mechanism,
- Diagnosis,
- Risk Factors,
- Therapeutics

FullText(HTML)

肝细胞癌（HCC）是人类最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内的发病率不断上升。尽管肝部分切除术和肝移植术是目前主要的治疗手段，但是很多患者确诊时已经丧失了手术机会，预后较差。虽然HCC的治疗已经取得一些新的进展，比如靶向药物治疗、免疫治疗等^［1-2］。但是HCC发生发展的机制仍然需要进一步深入探究。

驱动蛋白家族成员15（KIF15）具有四聚体纺锤马达结构，其马达结构域结构以ATP样构型，颈部接头与催化核心对接；通过水解ATP为多种物质的运输提供能量^［3-4］。KIF15在肿瘤中的作用被广泛报道，例如KIF15通过激活Raf/MEK/ERK通路促进非小细胞肺癌的恶性进展^［5］；KIF15上调促进泛素特异性蛋白酶15（USP15）介导的DEK去泛素化导致平滑肌肉瘤细胞生长^［6］；KIF15通过抑制活性氧介导的细胞凋亡促进胃癌进展^［7］。目前，KIF15在HCC中的作用尚不确切，因此本研究旨在探究KIF15在HCC中的潜在作用机制，为HCC的治疗提供新思路。

1. 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂

人正常肝细胞L02，人HCC细胞株HepG2、LM3、MHCC-97H和Hep3B（中国科学院细胞库）；KIF15过表达慢病毒（LV-KIF15）和对应的阴性对照（vector），KIF15敲低慢病毒（sh-KIF15）和对应的阴性对照（shNC）及相应的转染试剂HiTransG A/P（上海吉凯生物有限公司）；Trizol试剂（美国Thermo Fisher公司）；逆转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒与CCK8试剂（诺唯赞生物科技有限公司）；抑制剂LY294002（MCE公司）；EDU试剂盒（锐博生物有限公司）；Western Blot试剂盒（碧云天有限公司）。本研究中抗体包括KIF15、GAPDH、p-PI3K（Tyr458）、PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）、mTOR、p-mTOR（Ser2448）。DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（新赛美公司）；青链霉素双抗（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

使用DMEM（含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）培养人HCC细胞株HepG2、LM3、MHCC-97H、Hep3B和正常肝细胞L02，放于37 °C含5% CO₂的加湿培养箱中培养。每2天换液1次，当细胞生长汇合率超过85%时，胰蛋白酶消化后分皿传代培养。

1.2.2 慢病毒转染

将Hep3B和HepG2培养至状态良好，按每孔100万接种于6孔板中，进行慢病毒转染。Hep3B转染针对KIF15的干扰慢病毒LV-shKIF15（sh1、sh2和sh3）以及对照（sh-NC）；HepG2转染编码KIF15的慢病毒载体（LV-KIF15）以及对照（vector）。使用吉凯公司助转染试剂提高转染效率。培养2天后用含嘌呤霉素（2.5 μg/mL）的DMEM筛选培养。

1.2.3 qRT-PCR实验

将相应的HCC细胞培养至状态良好后收集，采用Trizol试剂提取细胞的总RNA，然后合成cDNA的反应混合物为20 μL/孔，由1 μg总RNA和4 μL 5×HiScript ‍Ⅱ‍qRT SuperMix及无RNase的ddH₂O组成。qRT-PCR的反应体系为：1 μL cDNA、5 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix、0.2 μL上游引物、0.2 μL下游引物和3.6 μL DEPC水。设定程序：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s， 60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，40个循环。KIF15 mRNA的相对表达量按2^-ΔΔCt法计算。

1.2.4 CCK-8实验

将稳定转染的HCC细胞种在96孔板（500个细胞/孔）中，分别于第1、2、3、4、5天相同时间，在每个孔加入CCK-8溶液（10 μL/孔），在培养箱中孵育2 h后，使用酶标仪测量每孔在450 nm处的吸光度（OD）值。

1.2.5 平板克隆实验

将培养的相应的HCC细胞按每孔500个/2 mL培养基密度接种于6孔板中，连续培养14天，弃掉培养基，PBS洗涤后用4%多聚甲醛固定细胞10 min，弃掉多聚甲醛后每个孔加入2 mL结晶紫染液，避光染色30 min后，PBS洗涤，等待自然干燥后，肉眼计数克隆形成的数目。

1.2.6 EdU实验

将稳定转染的细胞株接种于96孔板（2×10⁴个细胞/孔）中，用DMEM培养1天。然后，在37 ℃下用50 μmol/L的EdU孵育2 h。再用4%的甲醛溶液固定细胞30 min，然后用0.5%的TritonX-100渗透细胞株10 min。加入400 μL 1×ApolloR反应物，再加入400 μL Hoechest33342，PBS冲洗3次后观察EdU阳性细胞。最后通过显微镜拍摄细胞的图像。

1.2.7 Western Blot实验

收集Hep3B和HepG2细胞，加入包含PMSF和磷酸酶蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞30 min。收集蛋白样品并检测其浓度。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE（10%）凝胶电泳75 min，继而进行转膜。使用Western Blot快速封闭液室温孵育30 min。将条带置于相应一抗（1∶1 000）中4 ℃摇床上孵育过夜。第二天用TBST洗膜3次，每次10 min。然后将条带置于特异性二抗（1∶2 000）室温孵育2 h后，再次TBST洗膜3次，每次10 min。天能凝胶成像仪显影蛋白条带。Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。

1.2.8 动物实验

将稳定转染的sh-NC/sh3 Hep3B细胞培养至状态良好，按1×10⁶个细胞/100 μL PBS的密度重悬，接种于4周龄雌性BALB/c裸鼠的皮下，每组3只裸鼠，皮下注射肿瘤细胞。28天后摘下皮下瘤，计算肿瘤体积与肿瘤重量。将瘤块石蜡包埋、切片和脱蜡，分别进行Ki67和TUNEL染色。实验鼠购自扬州大学比较医学中心，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2022-0009，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2022-0034。

1.2.9 生物信息学分析

使用TCGA-LIHC数据集分析KIF15在HCC中的表达情况以及表达高低对临床预后的影响。GEPIA数据库分析KIF15在HCC中与肿瘤分期的关系以及对预后的影响。

1.2.10 GSEA分析

为了在TCGA-HCC数据集中研究与KIF15相关的潜在信号途径，故进行GSEA分析。首先，基于与KIF15表达的相关性，生成TCGA-HCC的FPKM转录数据中所有基因的有序列表。然后选择参考基因集“h.all.v6.2.entrez.Gmt”进行分析，最后使用GSEA软件（v2.10.1）分析KIF15高、低表达组之间的基因富集情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行数据统计分析。计量资料以x¯±s表示，两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1 KIF15在HCC中的相对表达情况和对生存率的影响

通过分析TCGA-LIHC数据集中KIF15的表达，发现在HCC癌组织中KIF15的表达量显著高于正常肝组织（P<0.05）（图1a、b）；GEPIA数据集分析发现，KIF15与HCC病理学分期呈正相关（P<0.05）（图1c）；qRT-PCR和Western Blot分析发现KIF15在HCC细胞株中表达增高，同时选取表达量最高Hep3B细胞株和较低的HepG2细胞株做后续探究（P<0.05）（图1d、e，表1）。

注： a、b为TCGA数据集中KIF15在HCC中的表达；c为TCGA数据集中KIF15与HCC分期的关系；d、e为qRT-PCR和Western Blot分析KIF15在HCC细胞株中的表达情况，与L02组比较，*P<0.001；f、g为TCGA和GEPIA数据集中KIF15表达与HCC生存的关系。

图 1 KIF15在HCC中的相对表达情况和对生存率的影响

Figure 1. The relative expression of KIF15 in hepatocellular carcinoma and its effect on survival rate

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表 1 Western Blot 检测KIF15蛋白在HCC细胞株中的表达水平

Table 1. The protein expression level of KIF15 in HCC cell lines by Western Blot

组别	KIF15
L02	1.00±0.02
HepG2	1.45±0.10^1）
LM3	5.22±0.39^1）
MHCC-97H	3.49±0.25^1）
Hep3B	7.69±0.61^1）
F值	192.40
P值	<0.001
注：与L02组比较，1）P<0.05。

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通过分析TCGA-LIHC数据集中KIF15与HCC的生存关系，发现KIF15高表达的患者生存率显著低于KIF15低表达者（P<0.05）（图1f）；分析GEPIA数据集中KIF15与HCC的生存关系，亦发现KIF15高表达的患者生存率显著低于KIF15低表达者（P<0.05）（图1g）。综上，KIF15在HCC中表达增高，且高表达患者生存更差。

2.2 KIF15对HCC增殖能力的影响

通过转染慢病毒敲低Hep3B细胞株中KIF15的表达量，qRT-PCR和Western Blot实验分析发现sh3慢病毒的敲低效率最高，与sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B细胞的KIF15 mRNA（0.17±0.05 vs 0.99±0.03，P<0.001）和蛋白水平（P<0.05）均显著下降（图2a，表2），并选择sh3-Hep3B细胞用于后续研究。其次，对转染慢病毒过表达HepG2细胞株中KIF15的表达量，通过qRT-PCR和Western Blot实验分析发现，与vector-HepG2相比，LV-KIF15-HepG2的KIF15 mRNA水平（11.37±1.17 vs 1.00±0.13，P<0.001）和蛋白水平（6.12±0.23 vs 0.99±0.06，P<0.001）均升高（图2b）。通过CCK-8实验分析发现，与sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B的细胞活力受到抑制（0.765±0.104 vs 1.560±0.135，P<0.05）（图2c）；而与vector-HepG2相比，LV-KIF15-HepG2的细胞活力显著增强（1.664±0.133 vs 1.056±0.123，P<0.05）（图2c）。通过GEPIA数据集分析显示，KIF15在HCC中与增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达呈正相关（P<0.05）（图2d），提示KIF15对于HCC增殖能力可能存在促进作用。

注： a，qRT-PCR验证Hep3B细胞中敲低KIF15的效率，与sh-NC比较，*P<0.01；b，qRT-PCR验证HepG2细胞中过表达KIF15的效率；c，CCK-8实验分析Hep3B和HepG2细胞增殖活力；d，GEPIA数据集中KIF15在HCC中的表达与PCNA的相关性；e、f，克隆形成实验分析Hep3B和HepG2细胞克隆数；g、h，EdU实验分析Hep3B和HepG2细胞增殖能力。

图 2 KIF15对HCC增殖能力的影响

Figure 2. Effect of KIF15 on proliferation of hepatocellular carcinoma

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表 2 Western Blot 检测KIF15蛋白在Hep3B中的表达水平

Table 2. The protein expression level of KIF15 in Hep3B by Western Blot

分组	KIF15
sh-NC	1.00±0.08
sh1	0.54±0.14^1）
sh2	0.66±0.08^1）
sh3	0.15±0.05^1）
F值	41.63
P值	<0.001
注：与sh-NC组比较，1）P<0.05。

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通过克隆形成实验分析发现，与sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B的克隆形成数显著减少（51.67±6.03 vs 118.33±11.59，P<0.001）（图2e）；而与vector-HepG2相比，LV-KIF15-HepG2的克隆形成数显著增多（172.00±7.55 vs 74.67±7.57，P<0.001）（图2f）。同时EdU染色实验显示，与sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B的EdU阳性率显著降低［（14.33±2.08）% vs （28.67±2.08）%，P<0.01］（图2g）；而与vector-HepG2相比，LV-KIF15-HepG2的EdU阳性率显著升高［（28.67±1.53）% vs （15.00±1.73）%，P<0.001］（图2h）。综上，KIF15能够促进HCC的增殖能力。

2.3 KIF15对HCC体内生长能力的影响

通过构建皮下瘤生长模型，探究KIF15对于HCC体内生长的影响。将稳定转染并生长状态良好的Hep3B细胞株（sh-NC/sh3）按照每100 μL中1×10⁶个细胞的数量，接种于裸鼠皮下，造模后皮下瘤瘤体见图3a。研究结果显示，与sh-NC-Hep3B细胞相比，sh3-Hep3B细胞皮下瘤体积［（350.00±100.00）mm³ vs （1 046.67±105.03）mm³，P<0.001］和重量［（366.67±110.15）mg vs （1 166.67±76.38）mg，P<0.001］均显著降低（图3b、c）。对皮下瘤进行免疫组化染色发现，sh3-Hep3B细胞皮下瘤Ki67的组化评分显著低于转染sh-NC-Hep3B的皮下瘤（2.33±0.58 vs 7.33±1.15，P<0.01）（图3d）；而转染sh3-Hep3B细胞皮下瘤TUNEL的组化评分显著高于sh-NC-Hep3B细胞的皮下瘤（5.33±1.15 vs 1.33±0.58，P<0.01）（图3e），提示敲低KIF15抑制了Hep3B皮下瘤的增殖能力，而增强了凋亡水平。综上，敲低KIF15能够抑制HCC的体内生长能力。

注： a，造模后皮下瘤瘤体照片；b，瘤体的体积；c，瘤体的重量；d、e，免疫组化染色分析Hep3B（sh-NC/sh3）瘤体组织中Ki67和TUNEL表达情况。

图 3 KIF15对HCC体内生长能力的影响

Figure 3. Effect of KIF15 on the growth capacity of hepatocellular carcinoma in vivo

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2.4 KIF15对HCC增殖能力影响的机制

通过GSEA分析KIF15在HCC中发挥作用的潜在机制，发现KIF15与PI3K/AKT/mTOR通路呈正相关（NES=1.59，P<0.001）（图4a）。Western Blot实验结果表明，与sh-NC-Hep3B细胞相比，sh3-Hep3B细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路受到显著抑制（P值均<0.001）（图4b，表3）；而与vector组相比，过表达KIF15能够促进HepG2细胞的PI3K/AKT/mTOR信号通路显著增强（P值均<0.001）（图4c，表4）；此外，PI3K抑制剂LY294002能够抑制LV-KIF15-HepG2细胞中的PI3K/AKT/mTOR信号通路（图4d，表5）。CCK-8实验结果表明，当LY294002抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路后，LY294002+LV-KIF15-HepG2细胞的活力较LV-KIF15-HepG2细胞明显下降（1.084±0.118 vs 1.670±0.102，P<0.01）（图4e）。平板克隆实验结果显示，相较于LV-KIF15-HepG2细胞，LY294002处理后的LV-KIF15-HepG2细胞的克隆形成能力受到显著抑制（78.33±7.64 vs 161.67±17.56，P<0.01）（图4f）。EdU染色实验显示，相较于LV-KIF15-HepG2细胞，LY294002处理后的LV-KIF15-HepG2细胞的EdU阳性率显著降低［（18.61±1.24）% vs （28.54±3.83）%，P<0.05］（图4g）。综上，KIF15通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进HCC的增殖能力。

注： a，GSEA分析KIF15在HCC中潜在的作用通路；b，Western Blot验证Hep3B细胞中PI3K/AKT/mTOR通路表达情况；c、d，Western Blot验证HepG2细胞中PI3K/AKT/mTOR通路表达情况；e，CCK-8实验分析HepG2细胞增殖活力；f，克隆形成实验分析HepG2细胞克隆数；g，EdU实验分析HepG2细胞增殖活力。

图 4 KIF15对HCC增殖能力影响的机制探究

Figure 4. The mechanism of the effect of KIF15 on the proliferation of hepatocellular carcinoma

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表 3 Western Blot 检测Hep3B细胞中相关蛋白表达结果

Table 3. Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in Hep3B cells

分组	KIF15	p-PI3K/PI3K	p-AKT/AKT	p-mTOR/mTOR
sh-NC	1.05±0.10	0.99±0.06	0.99±0.06	0.98±0.07
sh3	0.19±0.03	0.14±0.04	0.24±0.05	0.22±0.02
t值	13.88	19.66	16.71	17.48
P值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

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表 4 Western Blot 检测HepG2细胞中相关蛋白表达结果

Table 4. Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in HepG2 cells

分组	KIF15	p-PI3K/PI3K	p-AKT/AKT	p-mTOR/mTOR
vector	1.00±0.06	1.04±0.10	1.02±0.06	0.96±0.04
KIF15	6.12±0.20	5.11±0.22	4.56±0.49	4.56±0.55
t值	41.97	29.29	12.46	11.24
P值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

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表 5 LY294002抑制剂干预对HepG2细胞中相关蛋白表达的影响

Table 5. The effect of inhibitor LY294002 intervention on the expression of related proteins in HepG2 cells

分组	KIF15	p-PI3K/PI3K	p-AKT/AKT	p-mTOR/mTOR
vector	1.06±0.13	1.01±0.09	0.96±0.08	0.97±0.05
KIF15	5.68±0.35	4.64±0.57	4.70±0.51	4.82±0.37
KIF15+LY294002	5.42±0.25^1）	1.17±0.09^1）	1.07±0.12^1）	1.22±0.10^1）
F值	301.05	111.64	145.32	284.41
P值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
注：与KIF15组比较，1）P<0.05。

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3. 讨论

肝癌发病率和死亡率位列全球恶性肿瘤第6位和第4位，预计到2040年全球将有140万肝癌患者，且将有130万人死于肝癌^［8］。目前HCC的主要治疗方法是手术、介入、化疗和免疫治疗等，但是患者的复发率仍然较高，5年生存率仅约20%^［9-11］。因此，探究HCC发生和发展的机制，对HCC的诊治将提供重要的理论基础。

KIF15，又名kinesin-12，是一种微管相关蛋白，其功能是微管依赖转运或纺锤体组织的调节因子^［12-13］。已有大量研究^［14-15］揭示了KIF15在多种肿瘤中的作用。在胰腺癌中，KIF15通过招募USP10和磷酸甘油酸激酶1增强胰腺癌细胞的糖酵解能力，从而增强其恶性程度^［16］；敲低KIF15后，胶质瘤的增殖能力受到抑制^［17］；此外，KIF15在鼻咽癌组织中高表达，与鼻咽癌预后不良相关，敲低KIF15将抑制鼻咽癌细胞株的增殖和倾袭能力^［18］。在前列腺癌中，KIF15通过增强前列腺癌细胞的雄激素受体（AR）信号通路来促进恩杂鲁胺耐药；机制上，KIF15直接结合AR/AR-v7的N端，通过增加USP14与AR/AR-v7的蛋白结合，阻止AR/AR-v7蛋白的降解^［19］。HCC作为恶性程度较高的常见肿瘤，KIF15对HCC的作用尚不明确。

本研究通过分析TCGA和GEPIA数据库发现KIF15在HCC组织中表达显著增高，且KIF15高表达与HCC不良预后相关。通过qRT-PCR和Western Blot评估KIF15在HCC细胞株中的表达水平，选择HepG2过表达KIF15以及选择Hep3B敲低KIF15，验证过表达和敲低的效率后进行细胞实验的探究。结果显示，过表达KIF15导致HCC细胞株的增殖能力增强，而敲低KIF15能够抑制HCC细胞株的增殖；并且敲低KIF15能够抑制HCC的体内生长能力。上述结果表明KIF15在HCC中发挥促进增殖的促癌作用。

已有大量研究^［20-22］报道，PI3K/AKT/mTOR信号通路在癌症进展中发挥关键作用。TBK1通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进甲状腺癌进展^［23］；UHMK1通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肺腺癌的发生^［24］；STK3通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，降低胰腺癌细胞的增殖能力，并且促进癌细胞的凋亡^［25］。本研究通过GSEA分析发现KIF15在HCC中与PI3K/AKT/mTOR的激活呈正相关。通过Western Blot分析发现，过表达KIF15能够激活HepG2细胞的PI3K/AKT/mTOR通路，而敲低KIF15导致Hep3B细胞的PI3K/AKT/mTOR通路受到抑制。通过进一步实验发现，PI3K抑制剂LY294002能够抑制过表达KIF15的HepG2细胞中的PI3K/AKT/mTOR通路，并且导致细胞的增殖能力受到显著抑制。

综上所述，本研究证实KIF15通过激活PI3K/AKT/mTOR通路，发挥促进HCC的增殖能力，为KIF15作为肝癌的诊断标志和预后指标提供了理论依据，但是KIF15在HCC中的精确机制仍需深入探究。

References(41)

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

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沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

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