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肝星状细胞通过胱硫醚γ-裂解酶/硫化氢(CSE/H2S)调控肝细胞癌细胞凋亡的作用及其机制

尚宏伟 马亚楠 路欣 吕翎娜 丁惠国

尚宏伟, 马亚楠, 路欣, 等. 肝星状细胞通过胱硫醚γ-裂解酶/硫化氢(CSE/H2S)调控肝细胞癌细胞凋亡的作用及其机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2024, 40(11): 2238-2245. DOI: 10.12449/JCH241117.
引用本文: 尚宏伟, 马亚楠, 路欣, 等. 肝星状细胞通过胱硫醚γ-裂解酶/硫化氢(CSE/H2S)调控肝细胞癌细胞凋亡的作用及其机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2024, 40(11): 2238-2245. DOI: 10.12449/JCH241117.
SHANG Hongwei, MA Yanan, LU Xin, et al. Role and mechanism of hepatic stellate cells in regulating the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells through cystathionine γ-lyase/hydrogen sulfide[J]. J Clin Hepatol, 2024, 40(11): 2238-2245. DOI: 10.12449/JCH241117.
Citation: SHANG Hongwei, MA Yanan, LU Xin, et al. Role and mechanism of hepatic stellate cells in regulating the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells through cystathionine γ-lyase/hydrogen sulfide[J]. J Clin Hepatol, 2024, 40(11): 2238-2245. DOI: 10.12449/JCH241117.

肝星状细胞通过胱硫醚γ-裂解酶/硫化氢(CSE/H2S)调控肝细胞癌细胞凋亡的作用及其机制

DOI: 10.12449/JCH241117
基金项目: 

中德研究小组项目 (GZ1517)

利益冲突声明:本文不存在任何利益冲突。
作者贡献声明:尚宏伟负责实验指导,收集分析数据,撰写及修改论文;马亚楠负责实验设计,收集分析数据;路欣、吕翎娜负责收集分析数据;丁惠国负责课题设计,审核文章并最后定稿。尚宏伟和马亚楠对本文贡献等同,同为第一作者。
详细信息
    通信作者:

    丁惠国, dinghuiugo@ccmu.edu.cn (ORCID: 0000-0002-8716-4926)

Role and mechanism of hepatic stellate cells in regulating the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells through cystathionine γ-lyase/hydrogen sulfide

Research funding: 

Sino-German Cooperation Group (GZ1517)

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  • 摘要:   目的  肝星状细胞(HSC)和硫化氢(H2S)信号分子作为肝细胞癌(HCC)微环境中重要的组分,参与调控HCC的发生发展等多种生物学进程。本研究通过HSC与肝癌细胞系共培养,探讨HSC通过分泌H2S参与调控肝癌细胞凋亡的作用及其机制。  方法  以HSC细胞系(LX-2)及肝癌细胞系(HepG2、PLC/PRF/5)为研究对象。RT-qPCR和Western Blot(WB)法检测LX-2中H2S关键合成酶——胱硫醚γ-裂解酶(CSE)mRNA及表达水平;ELISA测定上清液LX-2产生的H2S浓度;二代测序、细胞免疫荧光、染色质免疫沉淀(ChIP)及WB检测H2S(内源性和外源性)作用HepG2和PLC/PRF/5细胞后,JNK/JunB-TNFSF14信号通路基因、结合位点及相关蛋白。Transwell小室将LX-2分别与HepG2和PLC/PRF/5共培养,CCK-8和流式细胞术检测肝癌细胞的细胞活力、凋亡,WB测定H2S-TNFSF14信号通路相关蛋白。所有细胞实验均重复3次。计量资料两组间比较采用成组t检验;多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析,进一步两两比较采用Dunnett-t检验。  结果  LX-2主要通过CSE合成H2S,LX-2培养上清液中H2S浓度随着时间延长逐渐增加[(22.89±0.08)pg/mL vs (28.29±0.15)pg/mL vs (36.19±1.90)pg/mL,F=79.63,P<0.05]。LX-2中CSE mRNA水平显著高于CBS mRNA和MPST mRNA(1.008±0.13 vs 0.320±0.014 vs 0.05±0.02, F=80.84,P<0.05)。当CSE被炔丙基甘氨酸(PPG)抑制之后,随着PPG浓度增加,H2S浓度下降(P<0.05)。LX-2分别与HepG2、PLC/PRF/5共培养,随着培养时间延长,HepG2(87.48%±0.82% vs 70.48%±0.641% vs 52.89%±0.57% vs 45.20%±0.69%, F=1 517.13,P<0.001)和PLC/PRF/5(92.41%±0.48% vs 74.10%± 0.73% vs 53.70%±0.60% vs 44.00%± 0.27%,F=2 626.21,P<0.001)细胞活力降低;凋亡增加(HepG2:12.88%±0.64% vs 15.5%±0.16% vs 18.43%±0.37% vs 13.01%±0.58%,F=142.15,P<0.001;PLC/PRF/5:8.51±0.05 vs 12.80±0.33 vs 15.59±0.21 vs 10.72±0.30,F=676.40,P<0.001),第3天最显著。二代测序显示,内源性H2S(LX-2产生)和NaHS(外源性H2S供体)参与调控HepG2中多种基因表达。NaHS和LX-2通过释放H2S,激活肝癌细胞中JNK/JunB信号通路、上调凋亡基因TNFSF14表达,且p-JunB与TNFSF14基因转录调控区域结合增加。  结论  在肝癌微环境中,HSC通过信号分子CSE/H2S,激活了肝癌细胞中JNK/JunB信号通路,TNFSF14表达增加,从而促进了肝癌细胞凋亡。

     

  • 肝星状细胞(HSC)作为肝细胞癌(HCC)微环境中最主要的窦周细胞,在HCC的发生发展中发挥了重要作用1-2。体外研究3-4表明,在HSC与HCC细胞的共培养体系中,HSC通过分泌生长因子、细胞外基质蛋白和金属基质蛋白酶诱导肿瘤细胞向恶性表型转化,同时增强肝癌细胞的侵袭与迁移能力。在皮下移植异种裸鼠肝癌模型5中发现,HSC通过促进HCC细胞增殖和抑制细胞凋亡,从而促进肿瘤生长。研究6-7还发现,HSC通过分泌血管内皮生长因子、血小板源性生长因子和转化生长因子等生长因子,促进肿瘤的血管生成。硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是继一氧化碳和一氧化氮后第3种重要的内源性气体信号分子,参与氧化应激、细胞增殖与凋亡、血管扩张、血管再生、炎症等多种病理生理过程8。内源性H2S由半胱氨酸和同型半胱氨酸经胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)、胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase, CBS)及3-巯基丙酮酸转硫酶(3-mercapto-pyruvate sulphurtransferase, MPST)合成产生9。前期研究10发现,外源性H2S供体——NaHS,通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导肝癌细胞自噬,从而促进了细胞凋亡,抑制细胞增殖与迁移。然而,在肝癌微环境中HSC是否通过H2S参与调控HCC的生物学过程尚不明确。因此,本研究通过HSC与肝癌细胞系共培养,探讨HSC通过分泌H2S参与调控肝癌细胞凋亡的作用及其机制。

    DMEM细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-链霉素、CSE抑制剂——炔丙基甘氨酸(propargylglycine, PPG)及JNK/JunB抑制剂——SP600125试剂购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;H2S检测ELISA试剂盒购自南京金益柏生物科技有限公司;RNA提取、逆转录及SYBR等RT-qPCR试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司;Transwell小室购自美国康宁公司;CCK-8试剂盒购自美国Abmole奥默生物公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司;人源β- actin、GAPDH、JNK、JunB、p-JNK/JunB抗体和二抗、ChIP试剂盒购自美国Cell Signaling technology公司;肿瘤坏死因子超家族成员-14(tumor necrosis factor superfamily member-14,TNFSF14)多克隆抗体购于美国Affinity Biosciences公司。

    肝星状细胞系(LX-2)及肝癌细胞系(HepG2、PLC/PRF/5),用含10%胎牛血清及1%的青霉素-链霉素混合液的DMEM培养基,置于37 ℃,5%(体积分数)CO2恒温细胞孵育箱内培养。Transwell小室建立共培养体系,上室接种LX-2,下室接种HepG2或PLC/PRF/5,按照说明书操作。所有细胞实验重复3次。

    LX-2产生的H2S浓度及NaHS释放的H2S,按照说明书进行操作。在酶标板对应的孔中分别加入标品及待检测的LX-2培养上清液和NaHS,随后进行孵育和洗板,加入显色液37 ℃孵育15 min,加入终止液终止反应。酶标仪450 nm波长测定,根据标准曲线,计算所测样本中H2S浓度。

    Trizol法提取总RNA。取1 μg总RNA,按照Takara逆转录试剂盒合成cDNA,SYBR Green Master Mix说明书配置20 μL RT PCR体系,ABI 7500进行RT-q PCR。所需的引物序列见表1。LX-2与HepG2共培养(LX-2共培养组)、NaHS处理HepG2(NaHS处理组)及对照组(单独HepG2培养)提取的HepG2细胞总RNA送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行转录组二代测序分析,对差异基因[以|log2(fold change)|≥1为差异表达基因的标准]进行聚类分析和Veen分析。

    表  1  RT-qPCR和ChIP-PCR所需要的引物序列
    Table  1.  Primers for Real-Time PCR and ChIP-PCR
    项目 寡核苷酸序列
    RT-qPCR引物
    TNFSF14 F:5'-CGTGAGACCTTCGCTCTTGTAT-3'
    R:5'-CCCTCAGTGTTTGTGGTGGAT-3'
    CSE F:5'-AAGACGCCTCCTCACAAGGT-3'
    R:5'-ATATTCAAAACCCGAGTGCTGG-3'
    GAPDH F:5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3'
    R:5'-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3'
    CBS

    F:5'-AATGGTGACGCTTGGGAA-3'

    R:5'-TGAGGCGGATCTGTTTGA-3'

    MPST

    F:5'-GACCCCGCCTTCATCAAG-3'

    R:5'-CATGTACCACTCCACCCA-3'

    ChIP-qPCR引物
    TNFSF14 F:5'-TTGTTCATTGCTGCATCCCC-3'
    R:5'-CTCCTCTTCTTCCGGTACCC-3'
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    取LX-2共培养组及NaHS处理组的HepG2细胞,PBS清洗2次,随后在10 cm2培养皿中加入1 mL RAPI裂解液,冰上裂解20 min,转移裂解液到EP管中,4 ℃,12 000×g离心30 min,上清即为细胞总蛋白。BCA试剂盒对提取的蛋白进行定量分析,加入对应体积的蛋白上样缓冲液后置于100 ℃金属浴5 min,使蛋白变性,用于后续WB检测。SDS-PAGE胶用于分析所提取的蛋白,取20 μg蛋白上样电泳,转膜,牛奶封闭,随后加入对应的抗体4 ℃孵育过夜,将孵育好的膜放到对应的二抗中,室温孵育1 h后,加入化学发光液测定和分析。

    将生长状态良好的细胞接种在96孔板,LX-2分别与HepG2、PLC/PRF/5共培养1、2、3、4天,单独HepG2、PLC/PRF/5培养分别作为对照组。按照说明书,每孔加入10 μL CCK-8试剂,随后置于37 ℃培养箱内孵育1 h后,酶标仪450 nm测定吸光度值。细胞活力计算:细胞活力(%)=[A450(样本-空白)]/[A450(对照-空白)]×100%。

    将处理好的细胞制备成为单细胞悬液,按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书,加入5 μL Annexin V孵育,再加入5 μL PI避光孵育,FACS流式细胞仪(BD公司)进行检测。

    细胞均匀接种到已放入无菌盖玻片的24孔板中,NaHS处理HepG2细胞0、1、2、8、24 h。取处理好的细胞,加入1 mL 4%多聚甲醛固定,随后进行透膜处理,加入1% BSA稀释抗体p-JunB(1∶500),4 ℃孵育过夜。1% BSA稀释FITC标记的荧光二抗(1∶500)避光条件下,室温孵育1 h。DAPI染核及封片,荧光显微镜下采集图像,Image J软件分析目的蛋白平均免疫荧光强度。

    LX-2分别与HepG2和PLC/PRF/5共培养,以及NaHS分别处理HepG2和PLC/PRF/5细胞后,ChIP方法测定p-JunB与TNFSF14启动子结合力。WB测定HepG2和PLC/PRF/5细胞核中p-JunB表达,应用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)对细胞核DNA染色(蓝色)和FITC标记的抗体测定细胞核p-JunB表达(绿色)。LX-2与NaHS处理后的HepG2和PLC/PRF/5细胞用4%多聚甲醛固定10 min,核酸酶将DNA特异性的消化为DNA片段,随后加入JunB、p-JunB抗体,从而特异性的富集目的蛋白质和DNA复合体,通过对复合体进行富集纯化,收集DNA用于PCR检测。

    采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料以x¯±s表示,两组间比较采用成组t检验;多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析,进一步两两比较采用Dunnett-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    LX-2培养上清液中H2S浓度随着时间延长逐渐增加[(22.89±0.08)pg/mL vs (28.29±0.15)pg/mL vs (36.19±1.90) pg/mL,F=79.63,P<0.05](图1a)。LX-2中CSE mRNA水平显著高于CBS mRNA和MPST mRNA(1.008±0.13 vs 0.320±0.014 vs 0.05±0.02, F=80.84,P<0.05)(图1b)。在LX-2中加入不同剂量PPG后,随着PPG浓度增加,H2S浓度下降(P<0.05)(图1c)。PPG特异性、浓度依赖性的降低CSE mRNA及蛋白水平(图1d、e)。

    注: a,LX-2细胞产生H2S的浓度;b,CSE、CBS和MPST的mRNA在LX-2细胞中的表达倍数;c,PPG处理后LX-2产生H2S的浓度;d,CSE的mRNA表达;e,CSE蛋白的表达水平。
    图  1  LX-2通过CSE途径产生H2S
    Figure  1.  LX-2 produce H2S mainly via the CSE

    LX-2分别与HepG2、PLC/PRF/5共培养,随着培养时间延长,HepG2(87.48%±0.82% vs 70.48%±0.641% vs 52.89%±0.57% vs 45.20%±0.69%,F=1 517.13,P<0.001)和PLC/PRF/5(92.41%± 0.48% vs 74.10%±0.73% vs 53.70%±0.60% vs 44.00%± 0.27%,F=2 626.21,P<0.001)细胞活力降低(图2a、b);凋亡增加(HepG2:12.88%±0.64% vs 15.5%±0.16% vs 18.43%±0.37% vs 13.01%±0.58%,F=142.15,P<0.001;PLC/PRF/5:8.51±0.05 vs 12.80±0.33 vs 15.59±0.21 vs 10.72±0.30,F=676.40,P<0.001),第3天最显著(图2c、d)。

    注: a,HepG2细胞活力;b,PLC/PRF/5细胞活力;c,HepG2细胞凋亡;d,PLC/PRF/5细胞凋亡。a、c,对照组为单独HepG2培养;b、d,对照组为单独PLC/PRF/5培养。与第1天比较,*P<0.05。
    图  2  LX-2与肝癌细胞系共培养对肝癌细胞活力及凋亡的影响
    Figure  2.  Effect of LX-2 co-culture with hepatoma cell on viability and apoptosis

    LX-2与HepG2共培养及NaHS处理HepG2后,转录组测序显示分别上调1 047和1 183个基因,共同上调659个基因;分别下调997和1 144个基因,共同下调342个基因(图3a)。其中,30个变化最大的基因,包括TGM2、PDE2A、AQP7P1、SOCS3、B3GNT3、LGALS7B、CPNE7、TCAF2、AXL、CD3D、BEAN1、KIF26B、SLC1A7、TFF1、IGFBP3、ADAMTS16、ACTA1、SLC2A5、SERPINE2、KCNMB4、LSP1、A4GALT、TNFSF14、NPPB、MUC5B、NKAIN4、TRAF5、PFKP、EHD2、MTMR11(图3b)。选择促凋亡基因TNFSF14进行分析,与对照组相比,NaHS处理组TNFSF14基因增加约2.8倍,LX-2共培养组TNFSF14基因增加约2倍(P<0.05)(图3c)。

    注: a,聚类分析;b,差异倍数值变化最大的30个差异基因;c,TNFSF14基因表达变化。对照组,单独HepG2培养。
    图  3  RNA-seq分析内源性和外源性H2S对HepG2细胞转录基因的影响
    Figure  3.  RNA-seq to analyse the transcriptome of endogenous and exogenous of H2S on HepG2

    ChIP实验发现,与对照组相比,NaHS处理的HepG2和PLC/PRF/5细胞中p-JunB与TNFSF14基因转录调控区域结合增加(图4a);p-JunB定位于细胞核中,NaHS作用1 h荧光强度开始升高,8 h达到高值(图4b);且与WB结果一致(图4c)。PPG干预后,HepG2和PLC/PRF/5胞核蛋白p-JunB表达明显下降(图4d);经SP600125(JNK/JunB抑制剂)处理后,显示JNK/JunB-TNFSF14信号通路被抑制。NaHS处理也显示了相似结果(图4e)。延长NaHS处理时间,细胞核p-JunB表达增加,但JunB表达无明显变化。结果提示,LX-2和NaHS通过释放H2S,激活JNK/JunB信号通路调控TNFSF14基因转录。

    注: a,ChIP显示,在HepG2和PLC/PRF/5细胞中,p-JunB与TNFSF14启动子结合力增加;b,NaHS分别处理HepG2和PLC/PRF/5 0、1、2、8、24 h后,HepG2和PLC/PRF/5细胞核中p-JunB表达及核转位,DAPI(蓝色)和FITC(绿色)分别为对细胞核DNA及p-JunB进行染色;c,NaHS不同处理时间后,HepG2和PLC/PRF/5细胞核与细胞质中p-JunB的表达;d,NaHS处理组和LX-2共培养组HepG2及PLC/PRF/5细胞的p-JunB蛋白变化;e,PPG和SP600125抑制了H2S及NaHS对HepG2与PLC/PRF/5中JNK/p-JNK、JunB/p-JunB、TNFSF14蛋白水平。
    图  4  内源性H2S和NaHS通过激活JNK/JunB信号通路调控TNFSF14转录
    Figure  4.  Endogenous H2S and NaHS upregulated TNFSF14 via JNK/JunB signaling pathway

    第3个重要的内源性气体信号分子H2S自1992年被发现,较多研究11-12证实了H2S及其合成酶的多种功能,参与了血管扩张、血管生成、炎症免疫、氧化应激和细胞凋亡与自噬的调控等过程,在肿瘤和非肿瘤性疾病,特别是心血管疾病的病理生理中具有重要作用。因此,H2S及其合成酶可能是治疗的靶点。但是,CSE/H2S在肝癌发生发展中的作用研究较少13。由肝细胞及肝窦周细胞,包括HSC、肝窦内皮细胞、Kuffer细胞、肝癌细胞和细胞外基质等组成的复杂肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中,HSC及信号分子H2S促进肝癌细胞凋亡的机制尚未阐明14。本研究发现,HSC主要通过CSE产生信号分子H2S,激活了肝癌细胞中的JNK/JunB信号通路,上调TNFSF14基因,TNFSF14表达增加,从而促进了肝癌细胞的凋亡,发挥抗肿瘤作用。Han等15发现,HepG2中TNFSF14下调Bcl-2和survivin,通过线粒体及p53独立途径,诱导肝癌细胞凋亡。体外研究16表明,在HepG2和SMMC-7721细胞中,TNFSF14与LT-βR结合,激活caspase-9和caspase-3,抑制STAT3磷酸化下调Bcl-XL表达,进而诱导肝癌细胞凋亡,提示线粒体途径也是TNFSF14诱导细胞凋亡的关键因素。由此可见,TNFSF14通过线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径等,促进肝癌细胞凋亡。此外,TNFSF14还表达于免疫细胞,如活化T淋巴细胞,未成熟树突状细胞和活化自然杀伤细胞,TNFSF14信号转导对T淋巴细胞激活和诱导细胞凋亡具有重要作用17。TNFSF14也通过激活抗肿瘤免疫效应,间接杀伤肿瘤细胞和触发肿瘤细胞凋亡,表现出强大的免疫抗肿瘤活性,在多种不同的肿瘤中发挥抗瘤作用18。因此推测,在肝癌微环境中,H2S通过激活肝癌细胞中凋亡基因TNFSF14表达及多种细胞凋亡信号途径,促进肝癌细胞凋亡。

    TNFSF14诱导肝癌细胞凋亡的分子机制尚不清楚。本研究ChIP实验证明,无论是在HepG2还是在PLC/PRF/5中,转录因子p-JunB均可与TNFSF14基因的转录调控区域结合,且H2S增强了p-JunB与TNFSF14基因启动子的结合能力。H2S生成酶CSE抑制剂——PPG和p-JNK抑制剂SP600125,均显著抑制了H2S对JNK/JunB信号通路的激活,导致TNFSF14表达降低。上述结果提示H2S在调节肝癌细胞TNFSF14表达中具有重要作用。细胞免疫荧光和WB也证明了外源性H2S供体NaHS及HSC合成的内源性H2S,促进了肝癌细胞p-JunB的表达及核转位。JunB作为Jun家族的重要成员之一,是转录因子AP-1(转录激活蛋白-1)的主要成分,对各种刺激如辐射、应激及生长信号等作出生理或病理应答,参与细胞增殖与分化、转化、凋亡、炎症等过程,在肿瘤的形成、转移和侵袭中发挥重要作用19。也有研究20发现,JNK/JunB促进HepG2凋亡并抑制了其增殖与侵袭能力。因此,本研究首次阐明了TNFSF14启动子的转录活性受到转录因子JunB的调控,H2S可激活转录因子JunB,促进p-JunB的核转位,进而上调肝癌细胞凋亡基因TNFSF14。CSE/H2S可能是防治HCC具有潜力的新靶点。

    总之,在TME中活化HSC合成分泌信号分子H2S,通过激活肝癌细胞中的JNK/JunB-TNFSF14信号通路,从而促进肝癌细胞凋亡、抑制肿瘤细胞活力,可能是HSC在TME中调节肝癌细胞生物学功能的新机制之一。

  • 注: a,LX-2细胞产生H2S的浓度;b,CSE、CBS和MPST的mRNA在LX-2细胞中的表达倍数;c,PPG处理后LX-2产生H2S的浓度;d,CSE的mRNA表达;e,CSE蛋白的表达水平。

    图  1  LX-2通过CSE途径产生H2S

    Figure  1.  LX-2 produce H2S mainly via the CSE

    注: a,HepG2细胞活力;b,PLC/PRF/5细胞活力;c,HepG2细胞凋亡;d,PLC/PRF/5细胞凋亡。a、c,对照组为单独HepG2培养;b、d,对照组为单独PLC/PRF/5培养。与第1天比较,*P<0.05。

    图  2  LX-2与肝癌细胞系共培养对肝癌细胞活力及凋亡的影响

    Figure  2.  Effect of LX-2 co-culture with hepatoma cell on viability and apoptosis

    注: a,聚类分析;b,差异倍数值变化最大的30个差异基因;c,TNFSF14基因表达变化。对照组,单独HepG2培养。

    图  3  RNA-seq分析内源性和外源性H2S对HepG2细胞转录基因的影响

    Figure  3.  RNA-seq to analyse the transcriptome of endogenous and exogenous of H2S on HepG2

    注: a,ChIP显示,在HepG2和PLC/PRF/5细胞中,p-JunB与TNFSF14启动子结合力增加;b,NaHS分别处理HepG2和PLC/PRF/5 0、1、2、8、24 h后,HepG2和PLC/PRF/5细胞核中p-JunB表达及核转位,DAPI(蓝色)和FITC(绿色)分别为对细胞核DNA及p-JunB进行染色;c,NaHS不同处理时间后,HepG2和PLC/PRF/5细胞核与细胞质中p-JunB的表达;d,NaHS处理组和LX-2共培养组HepG2及PLC/PRF/5细胞的p-JunB蛋白变化;e,PPG和SP600125抑制了H2S及NaHS对HepG2与PLC/PRF/5中JNK/p-JNK、JunB/p-JunB、TNFSF14蛋白水平。

    图  4  内源性H2S和NaHS通过激活JNK/JunB信号通路调控TNFSF14转录

    Figure  4.  Endogenous H2S and NaHS upregulated TNFSF14 via JNK/JunB signaling pathway

    表  1  RT-qPCR和ChIP-PCR所需要的引物序列

    Table  1.   Primers for Real-Time PCR and ChIP-PCR

    项目 寡核苷酸序列
    RT-qPCR引物
    TNFSF14 F:5'-CGTGAGACCTTCGCTCTTGTAT-3'
    R:5'-CCCTCAGTGTTTGTGGTGGAT-3'
    CSE F:5'-AAGACGCCTCCTCACAAGGT-3'
    R:5'-ATATTCAAAACCCGAGTGCTGG-3'
    GAPDH F:5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3'
    R:5'-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3'
    CBS

    F:5'-AATGGTGACGCTTGGGAA-3'

    R:5'-TGAGGCGGATCTGTTTGA-3'

    MPST

    F:5'-GACCCCGCCTTCATCAAG-3'

    R:5'-CATGTACCACTCCACCCA-3'

    ChIP-qPCR引物
    TNFSF14 F:5'-TTGTTCATTGCTGCATCCCC-3'
    R:5'-CTCCTCTTCTTCCGGTACCC-3'
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-08-07
  • 录用日期:  2024-08-26
  • 出版日期:  2024-11-25
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