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肝星状细胞通过胱硫醚γ-裂解酶/硫化氢（CSE/H2S）调控肝细胞癌细胞凋亡的作用及其机制
DOI: 10.12449/JCH241117
Role and mechanism of hepatic stellate cells in regulating the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells through cystathionine γ-lyase/hydrogen sulfide
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摘要:
目的 肝星状细胞（HSC）和硫化氢（H2S）信号分子作为肝细胞癌（HCC）微环境中重要的组分，参与调控HCC的发生发展等多种生物学进程。本研究通过HSC与肝癌细胞系共培养，探讨HSC通过分泌H2S参与调控肝癌细胞凋亡的作用及其机制。 方法 以HSC细胞系（LX-2）及肝癌细胞系（HepG2、PLC/PRF/5）为研究对象。RT-qPCR和Western Blot（WB）法检测LX-2中H2S关键合成酶——胱硫醚γ-裂解酶（CSE）mRNA及表达水平；ELISA测定上清液LX-2产生的H2S浓度；二代测序、细胞免疫荧光、染色质免疫沉淀（ChIP）及WB检测H2S（内源性和外源性）作用HepG2和PLC/PRF/5细胞后，JNK/JunB-TNFSF14信号通路基因、结合位点及相关蛋白。Transwell小室将LX-2分别与HepG2和PLC/PRF/5共培养，CCK-8和流式细胞术检测肝癌细胞的细胞活力、凋亡，WB测定H2S-TNFSF14信号通路相关蛋白。所有细胞实验均重复3次。计量资料两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t检验。 结果 LX-2主要通过CSE合成H2S，LX-2培养上清液中H2S浓度随着时间延长逐渐增加［（22.89±0.08）pg/mL vs （28.29±0.15）pg/mL vs （36.19±1.90）pg/mL，F=79.63，P<0.05］。LX-2中CSE mRNA水平显著高于CBS mRNA和MPST mRNA（1.008±0.13 vs 0.320±0.014 vs 0.05±0.02， F=80.84，P<0.05）。当CSE被炔丙基甘氨酸（PPG）抑制之后，随着PPG浓度增加，H2S浓度下降（P<0.05）。LX-2分别与HepG2、PLC/PRF/5共培养，随着培养时间延长，HepG2（87.48%±0.82% vs 70.48%±0.641% vs 52.89%±0.57% vs 45.20%±0.69%， F=1 517.13，P<0.001）和PLC/PRF/5（92.41%±0.48% vs 74.10%± 0.73% vs 53.70%±0.60% vs 44.00%± 0.27%，F=2 626.21，P<0.001）细胞活力降低；凋亡增加（HepG2：12.88%±0.64% vs 15.5%±0.16% vs 18.43%±0.37% vs 13.01%±0.58%，F=142.15，P<0.001；PLC/PRF/5：8.51±0.05 vs 12.80±0.33 vs 15.59±0.21 vs 10.72±0.30，F=676.40，P<0.001），第3天最显著。二代测序显示，内源性H2S（LX-2产生）和NaHS（外源性H2S供体）参与调控HepG2中多种基因表达。NaHS和LX-2通过释放H2S，激活肝癌细胞中JNK/JunB信号通路、上调凋亡基因TNFSF14表达，且p-JunB与TNFSF14基因转录调控区域结合增加。 结论 在肝癌微环境中，HSC通过信号分子CSE/H2S，激活了肝癌细胞中JNK/JunB信号通路，TNFSF14表达增加，从而促进了肝癌细胞凋亡。 Abstract:Objective As important components in the microenvironment of hepatocellular carcinoma （HCC）， hepatic stellate cells （HSCs） and hydrogen sulfide （H2S） participate in various biological processes that regulate the development and progression of HCC. Through the co-culture of HSCs and HCC cells， this article aims to investigate the role and mechanism of HSCs in regulating the apoptosis of HCC cells by secreting H2S. Methods The HSC cell line （LX-2） and HCC cell lines （HepG2 and PLC/PRF/5） were used for experiment. RT-qPCR and Western Blot （WB） were used to measure the mRNA and protein expression levels of cystathionine γ-lyase （CSE）， a key synthase for H2S； ELISA was used to measure the concentration of H2S in supernatant； next-generation sequencing， cell immunofluorescence assay， chromatin immunoprecipitation （ChIP）， and WB were used to measure the JNK/JunB-TNFSF14 signaling pathway genes， binding sites， and related proteins after HepG2 cells were treated by H2S. LX-2 cells were co-cultured with HepG2 or PLC/PRF/5 cells in a Transwell chamber； CCK-8 assay and flow cytometry were used to measure the viability and apoptosis of HCC cells， and WB was used to measure the H2S-TNFSF14 signaling pathway-related proteins. All cell experiments were repeated three times. The independent-samples t test was used for comparison of continuous data between two groups； a one-way analysis of variance or the analysis of variance with repeated measures was used for comparison between multiple groups， and the Dunnett-t test was used for further comparison between two groups. Results LX-2 cells synthesized H2S mainly through CSE， and the concentration of H2S in supernatant of LX-2 cells gradually increased over time （22.89±0.08 pg/mL vs 28.29±0.15 pg/mL vs 36.19±1.90 pg/mL， F=79.63， P<0.05）. In LX-2 cells， the mRNA expression level of CSE was significantly higher than that of CBS and MPST （1.008±0.13 vs 0.320±0.014 vs 0.05±0.02， F=80.84， P<0.05）. When CSE was inhibited by PPG， the concentration of H2S decreased with the increase in the concentration of PPG （P<0.05）. LX-2 cells were co-cultured with HepG2 or PLC/PRF/5 cells， and over the time of culture， there were significant reductions in the viability of HepG2 cells （87.48%±0.82% vs 70.48%±0.641% vs 52.89%±0.57% vs 45.20%±0.69%， F=1 517.13， P<0.001） and PLC/PRF/5 cells （92.41%±0.48% vs 74.10%±0.73% vs 53.70%±0.60% vs 44.00%±0.27%， F=2626.21， P<0.001） and significant increases in the apoptosis of HepG2 cells （12.88%±0.64% vs 15.5%±0.16% vs 18.43%±0.37% vs 13.01%±0.58%， F=142.15， P<0.001） and PLC/PRF/5 cells （8.51±0.05 vs 12.80±0.33 vs 15.59±0.21 vs 10.72±0.30， F=676.40， P<0.001）， with the most significant changes on day 3. Next-generation sequencing showed that endogenous H2S and NaHS （endogenous H2S donor） were involved in regulating the expression of various genes in HepG2 cells. By releasing H2S， NaHS and LX2 activated the JNK/JunB signaling pathway and upregulated the expression of the apoptosis gene TNFSF14 in HCC cells， with increased binding between p-JunB and the transcriptional regulatory regions of the TNFSF14 gene. Conclusion In the microenvironment of HCC， HSCs activate the JNK/JunB signaling pathway in HCC cells through the signal molecules CSE/H2S， and there is an increase in the expression of TNFSF14， thereby promoting the apoptosis of HCC cells. -
Key words:
- Carcinoma， Hepatocellular /
- Hepatic Stellate Cells /
- Hydrogen Sulfide
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1. 低病毒血症（low-level viremia，LLV）再认识
共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）对HBV的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙型肝炎患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的目标。cccDNA是目前慢性HBV感染无法完全根除的主要原因［1-2］，随着检测试剂灵敏度的提高，目前HBV DNA定量下限可达10～20 IU/mL，甚至更低。高灵敏的实时定量聚合酶链式反应（PCR）检测对HBV DNA的临床可及性衍生出新的问题，即低病毒载量患者如何定义、可能的危害以及是否需要干预［3］。
2017年，韩国一项关于LLV长期临床影响的研究［4］回顾性分析了875例接受恩替卡韦（ETV）单药治疗的初治慢性乙型肝炎患者（其中443例肝硬化，占50.6%），比较持续病毒学应答（SVR）患者（定义为HBV DNA<12 IU/mL）和LLV（定义为HBV DNA持续或间歇性高于检测下限但<2 000 IU/mL）患者的肝细胞癌（HCC）发生率。中位随访时间为4.5（1.0～8.7）年，85例（9.7%）患者被诊断为HCC。LLV患者5年HCC发生率明显高于SVR患者（14.3% vs 7.5%，P=0.015）。在肝硬化患者中，LLV患者5年HCC发生率明显高于SVR患者（23.4% vs 10.3%，P=0.002）。研究表明，在ETV单药治疗期间，LLV与更高的HCC发生风险相关，特别是在肝硬化患者中，表明LLV是HCC发生的独立危险因素。因此，LLV对抗病毒治疗获益的影响开始受到重视。
2018年之前并未有关于低病毒载量的定义，虽然目前国内外对LLV尚无公认统一的定义，但已有相关研究证实低病毒载量存在临床危害。2018年美国肝病学会（AASLD）指南［5］提出：LLV是指HBV DNA<2 000 IU/mL但仍能检测到（最低检测限为10 IU/mL）的患者。我国《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》［3］提出：尽管强效低耐药口服抗病毒治疗能够使HBV复制受到强力抑制，但部分患者仍存在应答不佳及LLV。接受ETV、替诺福韦酯（TDF）、丙酚替诺福韦（TAF）、艾米替诺福韦且依从性好的慢性乙型肝炎患者，治疗48周及以上，若仍可检测到HBV DNA但<2 000 IU/mL者可定义为LLV。目前，有学者［6］提出LLV可分为两类：（1）持续性LLV，即经过灵敏的实时荧光定量PCR检测至少2次，每次间隔3～6个月，血清HBV DNA均为阳性，但均<2 000 IU/mL；（2）间歇性LLV，即经过灵敏的实时荧光定量PCR检测至少3次，每次间隔3～6个月，HBV DNA呈间歇性阳性，但<2 000 IU/mL。
诊断LLV需满足的前提：（1）排除检测过程中出现高精度HBV DNA假阳性，导致的原因包括检测试剂因素、标本因素、操作因素。若出现假阳性的情况，需要再次规范地复测，尽量排除检测方面的错误。（2）接受一线核苷（酸）类似物（NAs）规范抗病毒治疗至少48周。（3）确认患者的依从性，明确有无漏服或减量抗病毒药，或服药方法不当（如ETV未遵从餐前或餐后至少2 h空腹服用等）。（4）排除耐药突变导致的病毒学突破。
2. LLV的临床危害
慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治疗后，LLV与肝纤维化进展、失代偿期肝硬化和HCC发生风险及患者长期生存率降低密切相关。
一项674例接受抗病毒治疗超过12个月的队列研究［7］的中位随访时间为42个月，LLV患者相较于SVR患者的终末期肝病（失代偿期肝硬化和肝癌）和HCC发生风险更高，提示LLV是慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治疗后进展为终末期肝病和肝癌的独立危险因素。另有研究［8］纳入212例接受根治性肝切除术的HBV相关HCC患者，分为LLV组（HBV DNA<2 000 IU/mL）和对照组（HBV DNA≥2 000 IU/mL），术后LLV组肿瘤复发率明显低于对照组（40.4% vs 54.6%，P<0.05），中位无复发生存期明显高于对照组（30.1个月 vs 17.6个月，P<0.01）；多因素分析显示，HBV DNA≥100 IU/mL是根治性肝切除术后肝癌复发的独立危险因素。目前，抗病毒治疗对LLV HBV相关HCC患者病死率的影响尚不明确。有研究［9］显示，抗病毒治疗是LLV HBV相关HCC患者5年病死率的独立保护因素，抗病毒治疗可显著降低HBV DNA低水平HCC患者的死亡率。
尽管接受强效抗病毒治疗，但部分慢性HBV感染者仍出现肝纤维化进展，为明确相关危险因素，有研究［10］在抗病毒治疗78周前后收集肝活检样本，纤维化进展定义为Ishak分期增加≥1或按北京标准（P-I-R分型）定位为主要进展。共纳入239例慢性HBV感染者，纤维化进展的独立危险因素是第78周时更高的HBV DNA检测率（OR=4.84，95%CI：1.30～17.98，P=0.019）和饮酒（OR=23.84；95%CI：2.68～212.50，P=0.004）；第78周时纤维化进展患者的血液样本中检测到HBV DNA的比例显著高于纤维化逆转组（50% vs 19%，P=0.015），提示LLV可能促进纤维化进展。
同时，也有部分研究未观察到LLV加重终末期肝病的风险。目前，有关LLV的危害尚缺乏更多前瞻性研究数据，NAs治疗下LLV患者的预后值得关注。2018年AASLD指南提出：对于HBeAg阴性、抗-HBe阳性、ALT正常且HBV DNA<2 000 IU/mL的患者应在第1年每3个月行1次ALT监测，以验证患者处于“非活动期”，此后每6～12个月开展1次监测。如果ALT水平升高，提高监测频率。此外，对于持续或复发性ALT升高，应启动额外的原因评估（例如HBV DNA检测）。HBsAg定量结合HBV DNA检测可能有助于区分处于“灰色地带”的HBeAg阴性患者，其中HBV DNA或ALT水平处于非活动性慢性乙型肝炎和免疫活性、HBeAg阴性慢性乙型肝炎之间的边界，长期存在的LLV是否影响慢性乙型肝炎患者的临床结局，目前相关研究较少，尚需积累更多证据。
3. 导致LLV发生的因素
目前，各大指南推荐ETV、TAF和TDF作为抗病毒治疗的一线药物，均具有高耐药屏障、良好的安全性和更好的抗病毒效果。慢性乙型肝炎患者经过长期抗病毒治疗可获得SVR，但部分患者仍可能长期维持LLV。随着实时荧光定量PCR技术的出现，HBV DNA检测的灵敏度有所提高，既往临床上被认为获得SVR的患者，在经过高灵敏度的HBV DNA检测后，也被证实仍存在低水平的病毒复制。LLV作为抗病毒治疗反应不佳的一种特例，近些年已成为慢性乙型肝炎抗病毒研究的热点。有研究［11］证实，LLV患者发生病毒学突破、耐药、肝纤维化和HCC的风险更高，但导致LLV的相关机制及影响因素目前并未阐明。
根据现有研究，LLV的发生机制可能包括：（1）与NAs竞争性抑制病毒复制的作用机制的局限性有关；（2）与患者的宿主免疫，尤其是抗HBV特异性免疫状态相关，宿主免疫相对较弱的患者免疫清除感染肝细胞能力更低，双链松弛环状DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）的从头合成维持在较高水平，导致LLV的发生；（3）感染肝细胞核内持续存在的cccDNA是HBV复制的源头［12］。
近年来，有研究关注到慢性乙型肝炎患者行抗病毒治疗期间发生LLV的影响因素。在长期接受ETV治疗（>1年）的慢性乙型肝炎患者中，HBV DNA高载量、HBsAg高表达和HBeAg阳性患者进展为LLV风险较高，建议针对该人群开展动态监测［11］。另一项前瞻性、多中心研究［13］显示，在基线和抗病毒治疗第78周接受肝活检的慢性乙型肝炎患者（n=394）中，基线时HBV DNA水平≥8 log10 IU/mL（OR=3.727，95%CI：1.851～7.505，P<0.001）、抗-HBc水平<3 log10 IU/mL（OR=2.384，95%CI：1.223～4.645，P=0.011）和HBeAg血清阳性（OR=2.871，95%CI：1.563～5.272，P<0.001）是发生持续性LLV的危险因素。此外，有研究［14］发现HBeAg血清阳性和较高的HBsAg水平是慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治疗期间发生极低LLV的危险因素，且可用于风险预测。
总之，当慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治疗48周后仍保持HBeAg阳性且HBsAg水平较高时，应重点关注LLV的风险，并保证使用高灵敏度的HBV DNA检测方法。基于现有研究相关指标的预测能力有限，且有必要考虑长期并发症或临床结果，尚需开展大样本量、包含更多观察指标和更长随访时间的高质量前瞻性研究。
4. LLV的治疗策略
在真实世界中，即使长期服用一线抗病毒药物（ETV、TDF），仍有部分慢性乙型肝炎患者发生LLV［15］。欧洲肝病学会指南提出，对于HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，接受NAs治疗48周或52周后，ETV治疗组患者血清HBV DNA可检出率为33%，TDF治疗组为24%［16］。尽管2018年AASLD指南建议，对NAs单药治疗出现持续性或间歇性LLV的患者继续维持原有的抗病毒治疗方案，但支持这一建议的证据级别不高。近年来，国内外一些临床研究尝试通过NAs相互转换的治疗策略，以提高经治LLV患者病毒学应答情况，例如换用或联合TDF、换用TAF或联合PEG-IFN-α治疗。
目前，对于抗病毒治疗期间出现LLV的患者可选方案主要有3种：（1）传统治疗，即改用另一种具有高遗传屏障的抗病毒单一疗法，或添加具有互补耐药性的第2种抗病毒药物。（2）AASLD指南建议接受ETV或TDF单药治疗的LLV患者继续单药治疗。继续单一治疗可延长NAs治疗的时间。但长期使用ETV或TDF治疗可能增加LLV发生率，有导致肝病进展的风险；（3）在换药或加药基础上进一步联合PEG-IFN-α治疗，可有效抑制病毒复制。
对ETV经治后LLV的慢性乙型肝炎患者，更换TAF抗病毒治疗能够有效提高LLV患者的HBV DNA及HBeAg阴转率，且能够明显改善患者肝肾功能、减轻肝纤维化程度，治疗安全性好［17］。一项来自我国的临床研究［18］评估了ETV治疗的LLV患者从ETV转换为TAF的有效性和安全性，102例患者从ETV转换为TAF治疗（TAF组），109例患者接受继续ETV单药治疗（ETV组），治疗24周后，TAF组的完全病毒学应答和ALT复常率为62.7%和47.6%，高于ETV组的9.3%和10.5%（OR=16.4，95%CI：6.6～40.0，P<0.001），提示对于接受ETV治疗的LLV患者，转用TAF相较于继续ETV治疗在病毒学和生化学应答方面的获益更佳。
同时，有研究［19］尝试对ETV部分病毒学应答的慢性乙型肝炎患者改用TDF单药治疗（n=63）或TDF+ETV联合治疗（n=80），主要疗效结局为病毒学应答，次要疗效结局为HBeAg血清转化和ALT正常化；48周时，TDF+ETV组病毒学应答发生率高于TDF组（88.8% vs 71.4%，P=0.009），HBeAg血清转换率高于TDF组（30% vs 15.9%，P=0.049），两组ALT升高患者比例无统计学差异。研究表明，对于ETV部分病毒学应答的慢性乙型肝炎患者，TDF+ETV联合治疗48周相较于TDF单药治疗具有更高的病毒学应答率。
另有研究［20］观察ETV治疗慢性乙型肝炎伴LLV后序贯或联合TAF的疗效及影响因素，根据治疗期间的HBV DNA水平将患者分为完全病毒学应答组（n=84）和LLV组（n=42），LLV组患者根据持续抗病毒治疗至96周分为3组：继续使用ETV为对照组、改用TAF组以及ETV联合TAF组，结果显示，序贯或联合TAF抗病毒治疗能够更有效地提高ETV治疗后伴LLV的慢性乙型肝炎患者的96周病毒应答率，改善肝肾功能，减轻肝纤维化程度。
5. 小结
LLV是目前乙型肝炎治疗研究的难点和热点，虽然近年来已有较多研究开展，但目前关于LLV的诊断和治疗尚未形成广泛共识。关于LLV仍有如下问题需要进一步探讨：（1）LLV的判断标准及其发生机制；（2）寻找LLV发生的影响因素；（3）明确LLV对临床转归的影响；（4）制订规范的LLV干预方案。期待未来能够开展更多大样本临床队列研究，为LLV的治疗提供新的思路和方案。
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注： a，LX-2细胞产生H2S的浓度；b，CSE、CBS和MPST的mRNA在LX-2细胞中的表达倍数；c，PPG处理后LX-2产生H2S的浓度；d，CSE的mRNA表达；e，CSE蛋白的表达水平。
图 1 LX-2通过CSE途径产生H2S
Figure 1. LX-2 produce H2S mainly via the CSE
注： a，HepG2细胞活力；b，PLC/PRF/5细胞活力；c，HepG2细胞凋亡；d，PLC/PRF/5细胞凋亡。a、c，对照组为单独HepG2培养；b、d，对照组为单独PLC/PRF/5培养。与第1天比较，*P<0.05。
图 2 LX-2与肝癌细胞系共培养对肝癌细胞活力及凋亡的影响
Figure 2. Effect of LX-2 co-culture with hepatoma cell on viability and apoptosis
注： a，聚类分析；b，差异倍数值变化最大的30个差异基因；c，TNFSF14基因表达变化。对照组，单独HepG2培养。
图 3 RNA-seq分析内源性和外源性H2S对HepG2细胞转录基因的影响
Figure 3. RNA-seq to analyse the transcriptome of endogenous and exogenous of H2S on HepG2
注： a，ChIP显示，在HepG2和PLC/PRF/5细胞中，p-JunB与TNFSF14启动子结合力增加；b，NaHS分别处理HepG2和PLC/PRF/5 0、1、2、8、24 h后，HepG2和PLC/PRF/5细胞核中p-JunB表达及核转位，DAPI（蓝色）和FITC（绿色）分别为对细胞核DNA及p-JunB进行染色；c，NaHS不同处理时间后，HepG2和PLC/PRF/5细胞核与细胞质中p-JunB的表达；d，NaHS处理组和LX-2共培养组HepG2及PLC/PRF/5细胞的p-JunB蛋白变化；e，PPG和SP600125抑制了H2S及NaHS对HepG2与PLC/PRF/5中JNK/p-JNK、JunB/p-JunB、TNFSF14蛋白水平。
图 4 内源性H2S和NaHS通过激活JNK/JunB信号通路调控TNFSF14转录
Figure 4. Endogenous H2S and NaHS upregulated TNFSF14 via JNK/JunB signaling pathway
表 1 RT-qPCR和ChIP-PCR所需要的引物序列
Table 1. Primers for Real-Time PCR and ChIP-PCR
项目 寡核苷酸序列 RT-qPCR引物 TNFSF14 F：5'-CGTGAGACCTTCGCTCTTGTAT-3' R：5'-CCCTCAGTGTTTGTGGTGGAT-3' CSE F：5'-AAGACGCCTCCTCACAAGGT-3' R：5'-ATATTCAAAACCCGAGTGCTGG-3' GAPDH F：5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3' R：5'-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3' CBS F：5'-AATGGTGACGCTTGGGAA-3'
R：5'-TGAGGCGGATCTGTTTGA-3'
MPST F：5'-GACCCCGCCTTCATCAAG-3'
R：5'-CATGTACCACTCCACCCA-3'
ChIP-qPCR引物 TNFSF14 F：5'-TTGTTCATTGCTGCATCCCC-3' R：5'-CTCCTCTTCTTCCGGTACCC-3' 
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