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氨氯地平及左氨氯地平对大鼠体内仑伐替尼药物动力学的影响及其机制
DOI: 10.12449/JCH241118
Effect of amlodipine and levamlodipine on the pharmacokinetics of lenvatinib in rats and related mechanisms
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摘要:
目的 研究氨氯地平及左氨氯地平对仑伐替尼药物动力学的影响并探究相关机制。 方法 选取18只雄性SD大鼠随机分为3组，包括仑伐替尼（1.2 mg/kg）组、氨氯地平（1.0 mg/kg）联合仑伐替尼组和左氨氯地平（0.5 mg/kg）联合仑伐替尼组，每组各6只。分别用0.5%羧甲基纤维素钠、氨氯地平及左氨氯地平灌胃液预处理8 d，末次灌胃后给予仑伐替尼，并按照规定的采血时间点眼内眦静脉丛采血。采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定大鼠血浆中仑伐替尼的药物浓度，非房室模型计算药物动力学参数。采用RT-qPCR检测大鼠肝组织中细胞色素P450 3A1（CYP3A1）、P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）mRNA表达。符合正态分布的计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t检验；不符合正态分布的计量资料多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。 结果 3组间药时曲线下面积AUC0-∞（F=4.567，P<0.05）、清除率CLz/F（F=5.038，P<0.05）和峰浓度Cmax（F=11.667，P<0.01）比较差异均存在统计学意义（P值均<0.05），与仑伐替尼组比较，氨氯地平联合仑伐替尼组AUC0-∞升高36.1%（P<0.05）、CLz/F下降26.1%（P<0.05）、Cmax升高56.7%（P<0.01），左氨氯地平联合仑伐替尼组Cmax升高37.7%（P<0.05）；RT-qPCR结果显示，3组间CYP3A1、P-gp和BCRP mRNA的表达差异均有统计学意义（F值分别为10.160、5.350、5.237，P值均<0.05），与仑伐替尼组比较，氨氯地平联合仑伐替尼组大鼠肝脏CYP3A1、P-gp和BCRP mRNA表达水平明显下降（P值均<0.05），而左氨氯地平联合仑伐替尼组大鼠肝脏中CYP3A1 mRNA表达水平也明显下降（P<0.05）。 结论 氨氯地平可以增加仑伐替尼的体内暴露量，作用机制可能与抑制肝脏中CYP3A1、P-gp和BCRP的mRNA表达有关；而左氨氯地平仅增加仑伐替尼的峰浓度。 -
关键词:
- 癌， 肝细胞 /
- 大鼠， Sprague-Dawley /
- 氨氯地平 /
- 仑伐替尼
Abstract:Objective To investigate the effect of amlodipine and levamlodipine on the pharmacokinetics of lenvatinib and related mechanisms. Methods A total of 18 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into lenvatinib （1.2 mg/kg） group， amlodipine （1.0 mg/kg）+lenvatinib group， and levamlodipine （0.5 mg/kg）+lenvatinib group， with 6 rats in each group. The rats were pretreated with 0.5% sodium carboxymethyl cellulose， amlodipine or levamlodipine by gavage for 8 days， and lenvatinib was given after the last intragastric administration. Blood samples were collected from the intraocular canthus venous plexus at the specified time points. Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was used to measure the plasma concentration of lenvatinib in rats， and a non-compartment model was used to calculate pharmacokinetic parameters. RT-qPCR was used to measure the mRNA expression levels of cytochrome P450 3A1 （CYP3A1）， P-glycoprotein （P-gp）， and breast cancer resistance protein （BCRP） in rat liver tissue. A one-way analysis of variance was used for comparison of normally distributed continuous data between multiple groups， and the Dunnett-t test was used for further comparison between two groups； the Kruskal-Wallis H test was used for comparison of non-normally distributed continuous data between groups. Results There were significant differences between the three groups in the area under the concentration-time curve AUC0-∞ （F=4.567， P<0.05）， clearance rate CLz/F （F=5.038， P<0.05）， and peak concentration Cmax （F=11.667， P<0.01）. Compared with the lenvatinib group， the amlodipine+lenvatinib group had an increase in AUC0-∞ by 36.1% （P<0.05）， a reduction in CLz/F by 26.1% （P<0.05）， and an increase in Cmax by 56.7% （P<0.01）， and the levamlodipine+lenvatinib group had an increase in Cmax by 37.7% （P<0.05）. RT-qPCR showed that there were significant differences in the mRNA expression levels of CYP3A1， P-gp， and BCRP between the three groups （F=10.160， 5.350， and 5.237， all P<0.05）， and compared with the lenvatinib group， the amlodipine+lenvatinib group had significant reductions in the mRNA expression levels of CYP3A1， P-gp， and BCRP in rat liver tissue （all P<0.05）， while the levamlodipine+lenvatinib group had a significant reduction in the mRNA expression level of CYP3A1 in rat liver tissue （P<0.05）. Conclusion Amlodipine can increase the in vivo exposure of lenvatinib possibly by inhibiting the mRNA expression of CYP3A1， P-gp， and BCRP in the liver， while levamlodipine only increases the peak concentration of lenvatinib. -
Key words:
- Carcinoma， Hepatocellular /
- Rats， Sprague-Dawley /
- Amlodipin /
- Lenvatinib
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原发性肝癌是全球第六大常见癌症类型，目前我国原发性肝癌的发病率和死亡率高居恶性肿瘤第4位及第2位［1］。肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，占75%～90%［2-4］。靶向治疗的酪氨酸激酶抑制剂在HCC系统治疗中发挥重要作用。口服多受体酪氨酸激酶抑制剂仑伐替尼具有抗肿瘤增殖和免疫调节活性［5-6］，作为系统抗肿瘤治疗的一线药物，适用于不可切除的轻度肝功能不全（Child Pugh A级）的晚期肝癌患者［3］。
细胞色素P450 3A4（CYP3A4）是参与人体内仑伐替尼代谢的主要代谢酶，此外，仑伐替尼是P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）的一种底物，并且对P-gp及BCRP介导的转运有轻微抑制或无抑制作用［7-9］。目前，关于仑伐替尼相互作用的研究数据较少，临床上尚无相关药物相互作用的报道［10］。高血压（42%）、腹泻（39%）、食欲下降（34%）等是仑伐替尼临床治疗相关的最常见的不良反应，仑伐替尼与抗高血压药物联合用药情况较为普遍，其中钙通道阻滞剂（calcium channel blocker，CCB）是临床最常用的降压药物［11］，研究［12］表明，CCB与酪氨酸激酶抑制剂治疗期间血压显著降低相关。氨氯地平是一种临床常用的CCB，主要通过CYP3A4代谢，同时也是P-gp的底物［13-14］。钙拮抗剂通常对P-gp有不同程度的抑制作用［15］，有研究［16］结果表明，氨氯地平以浓度依赖性方式调节P-gp底物的转运体依赖的跨膜流量，同时，氨氯地平是BCRP中等强度抑制剂［17］。此外，氨氯地平可能通过抑制P-gp和CYP3A2提高大鼠体内他克莫司的血浓度［18］，作为P-gp的底物，氨氯地平可显著增加环孢素A的AUC0～2 h，显著增加环孢素A的吸收［19］。左氨氯地平是氨氯地平左旋体，相关药物动力学研究数据较少。因此，研究氨氯地平及左氨氯地平对仑伐替尼药物动力学的影响并初步探讨机制，将对临床合理联合用药具有重要意义。
1. 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
LC-30A型超高效液相色谱仪（日本岛津公司）含LC-30AD型二元高压梯度泵，SIL30AC型自动进样器，CTO30A柱温箱室；AB Sciex 5500型三重四极杆质谱仪（美国AB公司）配备Turbo VTM型电喷雾离子化源和三重四级杆质量分析器；EXT-C18色谱柱［月旭科技（上海）股份有限公司］；NewClassic电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）；涡旋振荡器（Thermo Scientific）；高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）；KQ5200E超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；S1010E型离心机（美国SCILOGEX公司）。-80 ℃超低温冰箱（美国Thermo Fisher公司）；ABI 7500实时荧光定量PCR仪（美国 Thermo Fisher公司）；组织包埋盒（江苏世泰实验器材有限公司）；Multiskan Mk3型酶标仪（芬兰Labsystems公司）；全自动样品冷冻研磨仪（上海净信实业发展有限公司）。
1.1.2 药品与试剂
仑伐替尼（纯度：98%，批号：Q75191201，石药集团）；2H5-仑伐替尼（纯度：99.5%，批号：ZZS-20-624-A9，上海甄准生物科技有限公司）；苯磺酸氨氯地平（纯度：99.9%，批号：100374-202106，中国食品药品检定研究院）；苯磺酸左氨氯地平（纯度：99.9%，批号：100546-202105，中国食品药品检定研究院）；羧甲基纤维素钠；乙腈、乙酸铵及甲酸（高效液相色谱纯级，赛默飞世尔科技有限公司）；纯水（娃哈哈饮用纯净水）；TRNzol Universal总RNA提取试剂（批号：Y1418）、FastKing cDNA第一链合成试剂盒（批号：y1915-zs）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）荧光定量预混试剂增强版（批号：y1822-zs）购自北京天根生化科技有限公司；引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成。
1.1.3 实验动物
健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，清洁级，体质量220～280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。大鼠在温度为23～27 ℃、湿度为40%～60%、12 h昼夜循环的控制环境中适应1周，动物可以自由进食和饮水。实验开始前12 h，禁食，可自由饮水。动物使用许可证号：SYXK（冀）2020-005。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件
色谱柱：EXT-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），含5 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）为流动相，采用梯度洗脱0～1 min：60%B；1～2 min：60%→90%B；2～4 min：90%B；4～4.1 min：90%→60%B；4.1～5.1 min：60%B。流速0.25 mL/min，进样体积为1 μL。
1.2.2 质谱条件
ESI 源正离子模式，离子源温度600 ℃，仑伐替尼的定量监测离子对为m/z 427.2→370.1，内标2H5-仑伐替尼的定量监测离子对为m/z 432.2→369.8（图1）。去簇电压DP为120 V，碰撞能量CE为34 V，气帘气为20.0 psi、源喷射电压为5 500 V、Gas 1为60.0 psi、Gas 2为65.0 psi。
1.2.3 储备液和工作液的制备
精密称取仑伐替尼适量，用二甲基亚砜（DMSO）溶解，得到浓度为2 mg/mL的储备液，用50%乙腈水逐级稀释为质量浓度为25 000、10 000、5 000、2 000、500、200、100、20 ng/mL的工作溶液。用相同的方法制备得到20 000、1 000、50 ng/mL的质控工作液。精密称取2H5-仑伐替尼适量，DMSO溶解得到1 mg/mL的储备液，用50%乙腈水稀释内标储备液得到50 ng/mL的内标工作溶液。
1.2.4 标准曲线和质控样本的制备
45 μL的空白血浆，分别加入5 μL的系列工作溶液，得到浓度为2、10、20、50、200、500、1 000、2 500 ng/mL标准曲线浓度点，同法制得浓度为5、100、2 000 ng/mL的质控样本。
1.2.5 血浆样品处理
50 μL血浆样品，加入内标工作溶液5 μL，300 μL乙腈，涡旋混合，13 400×g离心10 min。取上清液转移至进样小瓶用于进样分析。
1.3 方法学验证
1.3.1 选择性
通过比较6份来自不同大鼠的空白血浆、定量限血浆样本及大鼠灌胃给予仑伐替尼后真实血浆样品的峰面积，评价选择性，以确定血浆中是否有内源性成分干扰仑伐替尼的检测。
1.3.2 标准曲线和定量下限
标准曲线浓度为2、10、20、50、200、500、1 000、2 500 ng/mL，线性回归分析采用加权最小二乘法，以标准曲线的浓度为横坐标，分析物与内标的峰面积比为纵坐标，以1/x2为权重因子，进行曲线拟合得回归方程，定量下限为标准曲线浓度的最低点。
1.3.3 精密度和准确度
按照“1.2.5”项处理定量下限血浆样品和低、中、高浓度的质控样品，每一浓度平行进行6份，通过计算相对标准偏差（RSD）和相对误差（RE）来评估批内的精密度和准确度。通过连续3 d测定来评估批间精密度和准确度。质控样品RSD、RE应小于15%，定量下限的RSD、RE应小于20%。
1.3.4 提取回收率和基质效应
使用不同来源的空白大鼠血浆配制低、中、高浓度的质控样品，每个浓度6份，按前文“1.2.5”处理，进样记录峰面积为A；用乙腈沉淀空白血浆后得到基质溶液，向基质溶液加入低、中、高质控仑伐替尼及内标溶液，进样得到基质存在下的峰面积为B；用乙腈稀释仑伐替尼的质控溶液和内标工作液制备分析物和内标的纯溶液，进样得到不存在基质时的峰面积为C。提取回收率为A/B，基质效应为B/C。
1.3.5 稳定性
通过分析低、中、高浓度的质控样品，每个浓度6个样品，评估大鼠血浆中仑伐替尼的稳定性。考察仑伐替尼模拟血浆样品在室温下放置8 h，处理后的样品置于自动进样器中12 h的短期稳定性，冻融3次的稳定性，以及在-20 ℃下冻存30 d的长期稳定性。根据当天的标准曲线分析质控样品的浓度，测得浓度应当在标示浓度的85%～115%，RSD应小于15%。
1.4 药代动力学实验
18只雄性SD大鼠随机分为3组，每组6只，A组为仑伐替尼对照组，B组为氨氯地平联合仑伐替尼组，C组为左氨氯地平联合仑伐替尼组。氨氯地平、左氨氯地平及仑伐替尼灌胃液用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）（含2.5% DMSO）溶液配制。A组：连续8 d给予空白溶剂0.5% CMC-Na（含2.5% DMSO）；B组：连续8 d灌胃1.0 mg/kg的氨氯地平；C组：连续8 d灌胃0.5 mg/kg的左氨氯地平；在第8天灌胃1 min后，所有组均灌胃给予1.2 mg/kg的仑伐替尼。于仑伐替尼给药前以及给药后0.25、0.5、1、2、3、4、8、12、24、48、72、96 h从眼内眦静脉丛取约0.3 mL血置于肝素化的离心管中，在离心机中以7 200 r/min，离心9 min，将上层血浆转移至新的离心管中，冷藏备用［20］。按“1.2.5”处理血浆样品，按“1.2.1”“1.2.2”测定大鼠血浆中仑伐替尼的浓度。采用DAS 2.1.1软件非房室模型，计算药代动力学参数。
1.5 动物组织采集
采血结束后，继续分组灌胃氨氯地平及左氨氯地平8 d，以2%的戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水冲洗污物及血渍，滤纸吸干表面水分，转移至包埋盒中于液氮中速冻，最终转移至-80 ℃冰箱冻存使用。
1.6 RT-qPCR检测肝脏mRNA表达水平
使用总RNA快速抽提试剂盒提取肝组织中的总RNA，测定总RNA的浓度，根据260 nm与280 nm的吸光度（A）比值评估总RNA的纯度，该值在1.8～2.0。使用FastKing cDNA第一链合成试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。采用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒进行定量PCR反应。反应程序设置预变性95 ℃持续15 min，PCR反应（40个循环，95 ℃、10 s，60 ℃、32 s），引物序列见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequences基因 正向引物序列 反向引物序列 GADPH 5'-GCCTTCCGTGTTCCTACC-3' 5'-GCCTGCTTCACCACCTTC-3' P-gp 5'-TCTGGTATGGGACTTCCTTGGT-3' 5'-TCCTTGTATGTTGTCGGGTTTG-3' BCRP 5'-TGAAGAGTGGCTTTCTAGTCCG-3' 5'-TTGAAATTGGCAGGTTGAGGTG-3' CYP3A1 5'-TGCATTGGCATGAGGTTTGC-3' 5'-TTCAGCAGAACTCCTTGAGGG-3' 1.7 统计学方法
采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料采用
2. 结果
2.1 方法学验证
2.1.1 选择性
仑伐替尼和2H5-仑伐替尼的保留时间均为1.19 min。空白血浆、定量下限的仑伐替尼血浆样本对照组、仑伐替尼灌胃给药后大鼠实际血浆样本组的色谱图见图2。在分析物和内标的保留时间处没有干扰峰，其响应低于仑伐替尼定量下限的20%，说明空白血浆中的物质不干扰分析物的测定。
注： Ⅰ，仑伐替尼；Ⅱ，2H5-仑伐替尼（内标）。a，空白血浆；b，定量下限仑伐替尼血浆；c，实际灌胃仑伐替尼后大鼠血浆。图 2 分析物和内标化合物的典型色谱图Figure 2. Typical MRM chromatograms of analyte and IS2.1.2 标准曲线和定量下限
仑伐替尼在2～2 500 ng/mL具有良好的线性，典型的校准曲线为Y=0.198X+0.004 66（r>0.999）。所有标准曲线浓度点的回算浓度均在标示值的15%以内。定量下限为2 ng/mL，具有可接受的精密度与准确度。
2.1.3 精密度和准确度
仑伐替尼的批内、批间RSD在2.5%～6.1%范围内，批内、批间RE在2.7%～9.0%范围内，结果表明批内、批间精密度和准确度均在可接受的范围内，结果见表2。该方法具有良好的重现性。
表 2 大鼠血浆中仑伐替尼的精密度与准确度Table 2. Precision and accuracy of LEN in rat plasma理论质量浓度 批内（n=6） 批间（n=18） 实测质量浓度（ng/mL） RSD（%） RE（%） 实测质量浓度（ng/mL） RSD（%） RE（%） 2 ng/mL 2.09±0.12 5.6 4.5 2.05±0.09 4.6 2.7 5 ng/mL 5.47±0.15 2.7 9.0 5.45±0.14 2.5 9.0 100 ng/mL 102.90±3.56 3.5 2.9 103.22±4.38 4.2 3.2 2 000 ng/mL 2 068.33±126.56 6.1 3.4 2 067.78±107.73 5.2 3.4 2.1.4 提取回收率和基质效应
仑伐替尼的提取回收率和基质效应结果见表3，结果表明，仑伐替尼的提取回收率88.25%～97.91%，基质效应98.32%～104.23%，RSD在3.7%～12.6%范围内。该方法具有良好的提取回收，基质的存在不影响仑伐替尼的准确定量。
表 3 大鼠血浆中仑伐替尼的提取回收率和基质效应Table 3. Extraction recovery and matrix effect of LEN in rat plasma理论质量浓度 提取回收率（%） RSD（%） 基质效应（%） RSD（%） 2 ng/mL 88.25±5.49 6.2 100.00±12.6 12.6 100 ng/mL 97.84±4.48 4.6 98.32±4.54 4.6 2 000 ng/mL 97.91±3.82 3.9 104.23±4.00 3.7 2.1.5 稳定性
稳定性结果见表4，结果表明仑伐替尼血浆在室温下放置8 h，处理后的样品置于自动进样器中12 h，冻融3次（-20 ℃至室温，室温至-20 ℃）及在-20 ℃长期储存30 d都是稳定的。
表 4 在不同条件下大鼠血浆中仑伐替尼的稳定性Table 4. Stability of LEN in rat plasma under various conditions条件 理论质量
浓度（ng/mL）
实测质量
浓度（ng/mL）
精密度
RSD（%）
准确度
RE（%）
室温8 h 5 5.47±0.11 2.0 9.4 100 103.85±6.58 6.3 3.9 2 000 2 053.33±107.83 5.3 2.7 进样器中12 h 5 5.40±0.16 2.9 8.1 100 102.75±3.22 3.1 2.8 2 000 2 081.67±106.47 5.1 4.1 -20 ℃冻融3次 5 5.42±0.16 2.9 8.3 100 105.83±3.76 3.6 5.8 2 000 1 945.00±106.16 5.5 -2.8 -20 ℃ 30 d 5 5.31±0.11 2.0 6.2 100 102.58±6.39 6.2 2.6 2 000 1 928.33±51.15 2.7 -3.6 2.2 大鼠体内药物动力学结果
仑伐替尼单独给药与联合氨氯地平及左氨氯地平时仑伐替尼的血药浓度-时间曲线见图3，主要药代动力学参数见表5。结果显示，与对照组单独应用仑伐替尼相比，连续8 d灌胃氨氯地平，可使仑伐替尼的AUC0-∞升高36.1%（P<0.05）、CLz/F下降26.1%（P<0.05）、Cmax升高56.7%（P<0.01）；连续8 d灌胃左氨氯地平，使仑伐替尼Cmax升高37.7%（P<0.05）。
注： a，96 h内血药浓度-时间曲线；b，12 h内血药浓度-时间曲线。图 3 单独灌胃仑伐替尼和联合氨氯地平或左氨氯地平后仑伐替尼的血药浓度-时间曲线Figure 3. Plasma concentration-time curves of LEN after oral LEN alone andcombined with AML or LAML表 5 单独使用及联合氨氯地平或左氨氯地平时仑伐替尼的药代动力学参数Table 5. Pharmacokinetic parameters of lenvatinib alone andcombined with AML or LAML参数 仑伐替尼组
（n=6）
仑伐替尼联合
氨氯地平组（n=6）
仑伐替尼联合
左氨氯地平组（n=6）
统计值 P值 AUC0-t （μg/L·h） 9 807.06±1 390.15 13 416.18±3 350.05 11 963.61±2 347.96 F=3.393 0.061 AUC0-∞（μg/L·h） 11 142.51±2 246.41 15 160.55±3 308.921） 12 456.64±2 788.95 F=4.567 0.028 t1/2（h） 55.22±37.64 74.10±50.40 35.01±13.90 F=2.317 0.133 Tmax（h） 1.50（0.50～3.00） 1.00（0.50～3.00） 1.00（1.00～2.00） H=2.686 0.261 Vz/F（L/kg） 8.18±4.81 8.63±6.00 4.96±1.89 F=1.065 0.369 CLz/F（L·h-1·kg-1） 0.11±0.02 0.08±0.021） 0.10±0.02 F=5.038 0.021 Cmax（μg/L） 1 238.33±164.25 1 940.00±344.272） 1 705.00±197.051） F=11.667 0.001 注：AUC0-t，0到最后一个采血点的药物浓度曲线下面积；AUC0-∞，时间从0到无穷大的药物浓度曲线下面积；t1/2，药物体内消除半衰期；Tmax，达峰时间；Vz/F，表观分布容积；CLz/F，清除率；Cmax，药峰浓度。与仑伐替尼组比较，1）P<0.05， 2）P<0.01。
2.3 氨氯地平及左氨氯地平对肝脏mRNA表达水平的影响
3组间CYP3A1、P-gp和BCRP mRNA的表达差异均有统计学意义（F值分别为10.160、5.350、5.237，P值均<0.05），与仑伐替尼组比较，氨氯地平联合仑伐替尼组大鼠肝脏中CYP3A1、P-gp和BCRP mRNA表达明显受到抑制（P值均<0.05），而左氨氯地平联合仑伐替尼组大鼠肝脏中只有CYP3A1 mRNA表达明显受到抑制（P<0.05）（图4）。
图 4 大鼠肝脏CYP3A1、P-gp、BCRP的相对mRNA表达Figure 4. Relative mRNA expression of CYP3A1， P-gp， BCRP in rat liver3. 讨论
肿瘤患者共患病的情况普遍存在，因应对抗肿瘤治疗导致的不良反应而采取联合用药的情况也较为常见。由于肿瘤患者病情复杂，联合用药发生的药物相互作用较为隐匿，不易察觉。对于经常出现的联合用药进行相互作用研究，有助于临床遴选药物，保障患者合理用药。高血压是仑伐替尼最常见的不良反应，氨氯地平及左氨氯地平降压平稳、用药方便且价格便宜，为临床常用的降压药物。目前，已有降糖药物卡格列净、降压药物替米沙坦及保肝药物成分五味子甲素与仑伐替尼的相互作用研究［21-23］，但尚无CCB类降压药物与仑伐替尼相互作用研究报道，本实验对氨氯地平与左氨氯地平进行对比研究，立足临床联合用药，其结果具有一定的临床用药指导价值。
药代动力学结果表明，氨氯地平及左氨氯地平均对仑伐替尼的药代动力学参数有所影响，且氨氯地平相比左氨氯地平与仑伐替尼之间的药物相互作用更加显著。本研究中大鼠仑伐替尼给药剂量是按照人体12 mg每天换算而来，是体质量≥60 kg的患者使用的标准剂量，AUC升高至1.36倍，相当于给药剂量相应提高，可能增加高血压等不良反应的发生风险。由于接受仑伐替尼的患者出现不良事件的风险很高［11］，联合用药时，更应加强监测并及时调整。此外，氨氯地平使仑伐替尼的AUC0～∞升高至1.36倍，大于1.25倍且小于2倍，符合弱抑制药标准［24］，表明氨氯地平对大鼠仑伐替尼体内过程可能存在弱抑制，其作用机制可能是氨氯地平及左氨氯地平影响了大鼠肝脏中与仑伐替尼相关的代谢酶及转运体。
仑伐替尼在人体内主要经CYP3A4代谢，并且是P-gp、BCRP的底物，因此采用RT-qPCR检测大鼠肝脏P-gp、BCRP、CYP3A1（对应人类CYP3A4）的mRNA表达。RT-qPCR结果表明，氨氯地平可能通过抑制大鼠肝脏CYP3A1延缓仑伐替尼的代谢，通过抑制肝脏胆管膜上P-gp减缓仑伐替尼经胆汁排泄，从而整体延缓仑伐替尼代谢，增加仑伐替尼的体内暴露量；左氨氯地平可能通过抑制肝脏CYP3A1延缓仑伐替尼的代谢，一定程度上增加了仑伐替尼的体内暴露。
总之，当临床上应用仑伐替尼联合氨氯地平时，可能致使仑伐替尼体内暴露增加，进而增加不良反应。左氨氯地平相比氨氯地平，用药剂量低，不良反应少，且对仑伐替尼药物动力学影响更小，可能相对更安全。本研究是以大鼠为研究对象进行的药物动力学研究，受种属差异的影响，可能与人体体内情况并非完全一致，尚需进一步临床试验研究。
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注： Ⅰ，仑伐替尼；Ⅱ，2H5-仑伐替尼（内标）。a，空白血浆；b，定量下限仑伐替尼血浆；c，实际灌胃仑伐替尼后大鼠血浆。
图 2 分析物和内标化合物的典型色谱图
Figure 2. Typical MRM chromatograms of analyte and IS
注： a，96 h内血药浓度-时间曲线；b，12 h内血药浓度-时间曲线。
图 3 单独灌胃仑伐替尼和联合氨氯地平或左氨氯地平后仑伐替尼的血药浓度-时间曲线
Figure 3. Plasma concentration-time curves of LEN after oral LEN alone andcombined with AML or LAML
图 4 大鼠肝脏CYP3A1、P-gp、BCRP的相对mRNA表达
Figure 4. Relative mRNA expression of CYP3A1， P-gp， BCRP in rat liver
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
基因 正向引物序列 反向引物序列 GADPH 5'-GCCTTCCGTGTTCCTACC-3' 5'-GCCTGCTTCACCACCTTC-3' P-gp 5'-TCTGGTATGGGACTTCCTTGGT-3' 5'-TCCTTGTATGTTGTCGGGTTTG-3' BCRP 5'-TGAAGAGTGGCTTTCTAGTCCG-3' 5'-TTGAAATTGGCAGGTTGAGGTG-3' CYP3A1 5'-TGCATTGGCATGAGGTTTGC-3' 5'-TTCAGCAGAACTCCTTGAGGG-3' 
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表 2 大鼠血浆中仑伐替尼的精密度与准确度
Table 2. Precision and accuracy of LEN in rat plasma
理论质量浓度 批内（n=6） 批间（n=18） 实测质量浓度（ng/mL） RSD（%） RE（%） 实测质量浓度（ng/mL） RSD（%） RE（%） 2 ng/mL 2.09±0.12 5.6 4.5 2.05±0.09 4.6 2.7 5 ng/mL 5.47±0.15 2.7 9.0 5.45±0.14 2.5 9.0 100 ng/mL 102.90±3.56 3.5 2.9 103.22±4.38 4.2 3.2 2 000 ng/mL 2 068.33±126.56 6.1 3.4 2 067.78±107.73 5.2 3.4
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表 3 大鼠血浆中仑伐替尼的提取回收率和基质效应
Table 3. Extraction recovery and matrix effect of LEN in rat plasma
理论质量浓度 提取回收率（%） RSD（%） 基质效应（%） RSD（%） 2 ng/mL 88.25±5.49 6.2 100.00±12.6 12.6 100 ng/mL 97.84±4.48 4.6 98.32±4.54 4.6 2 000 ng/mL 97.91±3.82 3.9 104.23±4.00 3.7
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表 4 在不同条件下大鼠血浆中仑伐替尼的稳定性
Table 4. Stability of LEN in rat plasma under various conditions
条件 理论质量
浓度（ng/mL）
实测质量
浓度（ng/mL）
精密度
RSD（%）
准确度
RE（%）
室温8 h 5 5.47±0.11 2.0 9.4 100 103.85±6.58 6.3 3.9 2 000 2 053.33±107.83 5.3 2.7 进样器中12 h 5 5.40±0.16 2.9 8.1 100 102.75±3.22 3.1 2.8 2 000 2 081.67±106.47 5.1 4.1 -20 ℃冻融3次 5 5.42±0.16 2.9 8.3 100 105.83±3.76 3.6 5.8 2 000 1 945.00±106.16 5.5 -2.8 -20 ℃ 30 d 5 5.31±0.11 2.0 6.2 100 102.58±6.39 6.2 2.6 2 000 1 928.33±51.15 2.7 -3.6
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表 5 单独使用及联合氨氯地平或左氨氯地平时仑伐替尼的药代动力学参数
Table 5. Pharmacokinetic parameters of lenvatinib alone andcombined with AML or LAML
参数 仑伐替尼组
（n=6）
仑伐替尼联合
氨氯地平组（n=6）
仑伐替尼联合
左氨氯地平组（n=6）
统计值 P值 AUC0-t （μg/L·h） 9 807.06±1 390.15 13 416.18±3 350.05 11 963.61±2 347.96 F=3.393 0.061 AUC0-∞（μg/L·h） 11 142.51±2 246.41 15 160.55±3 308.921） 12 456.64±2 788.95 F=4.567 0.028 t1/2（h） 55.22±37.64 74.10±50.40 35.01±13.90 F=2.317 0.133 Tmax（h） 1.50（0.50～3.00） 1.00（0.50～3.00） 1.00（1.00～2.00） H=2.686 0.261 Vz/F（L/kg） 8.18±4.81 8.63±6.00 4.96±1.89 F=1.065 0.369 CLz/F（L·h-1·kg-1） 0.11±0.02 0.08±0.021） 0.10±0.02 F=5.038 0.021 Cmax（μg/L） 1 238.33±164.25 1 940.00±344.272） 1 705.00±197.051） F=11.667 0.001 注：AUC0-t，0到最后一个采血点的药物浓度曲线下面积；AUC0-∞，时间从0到无穷大的药物浓度曲线下面积；t1/2，药物体内消除半衰期；Tmax，达峰时间；Vz/F，表观分布容积；CLz/F，清除率；Cmax，药峰浓度。与仑伐替尼组比较，1）P<0.05， 2）P<0.01。
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