Association of inhibitory receptor T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain with immune disorders in chronic HBV infection

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）大多起病隐匿，是以肝细胞损伤为主要特点的慢性进行性疾病，流行病学调查显示该病的发病率逐年升高。随着近年来肠道微生态学研究的不断深入，关于微生态失调可能与AIH发病机制有关的研究逐渐增多。本文将对肠道微生态与AIH发病机制的关系进行总结，以期为临床诊断及治疗提供新视角和新策略。

1.   AIH概述

AIH是一种免疫相关的慢性肝脏炎症，更多见于中老年女性（55岁），以血清转氨酶、IgG升高，自身抗体阳性和中重度界面性肝炎为主要临床特征^［1］。据统计，AIH在芬兰的发病率为1.1/10万人年^［2］；在英国发病率呈上升趋势：从1997年的1.27/10万人年到2015年的2.56/10万人年^［3］；丹麦、日本、新西兰等国家也同样观察到发病率较前升高的现象^［4］。由于性别、年龄、种族、饮食习惯、社会经济水平等因素影响，目前AIH发病率为0.40/10万～2.39/10万，患病率为4.8/10万～42.9/10万。尽管AIH属于相对少见的疾病，但其带来的疾病负担不容忽视^［5］。目前尚未发现针对AIH的特异性抗体，诊断AIH需排除其他疾病，并结合多项血清学指标及特征性的中重度界面性肝炎。AIH的发病机制仍在探索阶段，包括遗传和环境因素，如人类白细胞抗原基因、病毒、寄生虫、酒精、药物、肠道菌群等^［6］。患有自身免疫性疾病的母亲肠道微生态异常，会改变婴儿肠道菌群的多样性和丰度^［7］。生命的早期，宿主和肠道菌群的相互作用受到干扰后可能会在成年时期表现为过度免疫反应，进一步转化为对炎症反应的易感性增加^［8］。不同种族之间的肠道微生物组存在差异，而宿主基因以种族特异性方式与肠道微生物群密切相关。高达3%的肠道微生态多样性与种族有关^［9］。不同种族人群中，AIH的发病年龄、病情严重程度、对药物治疗的反应、预后等都有着不同的表现^［10］。现有的治疗方案主要是采用非特异性免疫抑制剂延缓疾病进展，延长生存期，但仍有部分患者未能从目前的标准治疗方案中获益^［1］。因此，进一步明确AIH发病过程和疾病进展的关键因素，有助于该病的早期发现、诊断和治疗，从而探索针对性更强的治疗方案。

2.   肠道微生态概述

人体胃肠道内存在一个巨大的微生物生态系统，容纳着数万亿包括细菌、真菌、病毒在内的微生物，称为肠道微生态^［11］。人体肠道微生态稳定对生理活动正常进行有着举足轻重的影响，其核心结构是肠道微生物。随着年龄的增长，肠道微生物的数量和丰度动态变化，青少年和成年时期趋于稳定。通过对粪便进行16S rRNA基因测序定义人类肠道核心微生物群。健康成人肠道微生物群中拟杆菌门、厚壁菌门等核心微生物与人体共生，在生物合成、代谢、免疫等方面发挥了重要作用^［11］。

3.   AIH患者肠道微生态的临床特征及进一步研究的方向

3.1   AIH患者肠道微生态的临床特征

AIH的发病机制尚未有明确的定论，目前主要认为是遗传与环境因素相互作用，从而引起自身免疫系统异常活化，导致以T淋巴细胞浸润为主的肝细胞炎症反应，最终向肝硬化、肝细胞癌进展^［12］。在众多环境诱发因素中，肠道菌群与AIH的关系受到越来越多的关注。在我国东部地区，相较于健康人群，AIH患者肠道菌群的多样性、细胞运动性显著降低，梭状芽孢杆菌、RF39、瘤胃球菌科、里克内拉菌科、弧菌属、拟副杆菌和粪球菌的丰度降低，而韦永氏球菌属、克雷伯氏菌、链球菌和乳杆菌的丰度增加，且韦永氏球菌属的富集与疾病严重程度有关。韦永氏球菌、乳杆菌、芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌4个菌属联合用以诊断AIH，其受试者工作特征曲线下面积（AUC）为78%（95%CI：71%～84%）^［13］。在我国中部地区，同样观察到AIH患者肠道菌群的多样性较健康人群下降，韦永氏球菌属、粪杆菌属、克雷伯氏菌等15个属细菌丰度显著增加，通过随机森林模型筛选出毛螺菌科、韦永氏球菌属、拟杆菌属、罗氏菌属、反刍球菌科5个操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）作为AIH的最佳生物标志物，AUC为83.25%（95%CI：75.61%～90.89%）^［14］。德国一项研究^［15］纳入了治疗后的AIH患者与健康人群进行比较，发现AIH患者肠道菌群的多样性下降，粪杆菌属、双歧杆菌数量下降，链球菌属细菌数量增加。使用双歧杆菌和粪球菌属区分AIH患者和健康人群，AUC达到了89.8%；而用于区分AIH与原发性胆汁性胆管炎（PBC）患者，AUC达到了84.9%，提示肠道微生物菌群的差异性不仅有可能成为诊断AIH的标志物，还能为鉴别自身免疫性肝病的类型提供参考。

3.2   AIH患者肠道微生态进一步的研究方向

目前为止，研究的主要关注点基本集中在肠道细菌方面，缺乏对肠道中真菌或病毒群以及肠黏膜的微生物群落分析。由于肠道菌群处于动态变化，容易受年龄、性别、地域、饮食、药物等因素的影响，因此，仍需要扩大样本量，进行不同地区、多个年龄范围的国际多中心临床研究，进一步了解AIH患者肠道菌群的结构和功能。另一方面，部分微生物不可用实验室传统培养方法获得，利用16S rRNA基因测序技术鉴定微生物的种类和丰度是微生物生态学研究的一个突破，但16S rRNA基因测序技术可获得的序列信息有限，鉴定菌群只能精确到属水平。宏基因组测序技术的出现弥补了16S rRNA基因测序技术的不足，对菌群鉴定能够达到种水平，因此，需要增加宏基因组测序在AIH患者肠道菌群中的应用数据，为深入研究基因和功能层面联系提供依据，揭示二者的因果关系而非单纯的相关性，从而辅助建立肠道菌群对AIH的诊断模型。众所周知，肝组织学活检是确诊AIH和评估疗效非常重要的方法，但属于侵入性操作，有出血、感染等风险，可重复性和患者接受度较低。通过肠道菌群检测寻找AIH肝脏炎症和纤维化的非侵入性生物标志物，可作为诊断AIH个体并对其进行分层的方法之一。

4.   肠道微生态介导AIH的可能机制

4.1   肠道菌群失调对AIH的影响

三氯乙烯（trichloroethene，TCE）与AIH相关，将TCE暴露小鼠的粪便微生物群移植到抗生素治疗小鼠中，诱导了相关AIH表型并且增加了自身抗体和肝免疫细胞活化^［16］。该结果提示肠道菌群失调可能在自身免疫性疾病发病机制中发挥关键作用，但仍需要进行广泛的研究，以阐明与AIH发病机制有关的细菌微生物群。刀豆蛋白A（Con A）诱导的肝损伤极大地模拟了人类AIH的免疫和炎症反应，是迄今为止AIH研究最重要的模型。肠道菌群失调改变了小鼠对Con A诱导的肝损伤的易感性：拟酸杆菌下调肝细胞中CD95的表达，并抑制肝细胞凋亡，保护肝脏免受严重损害。将拟酸杆菌植入小鼠胃肠道内不会改变肠屏障完整性或通透性，推测可能是因拟酸杆菌的代谢产物通过门静脉进入肝脏发挥保护作用^［17］。肠道菌群失调直接或间接诱导肝脏免疫细胞产生炎症因子：伤寒沙门菌灌胃后引起肠道菌群失调，肠道固有层IL-17A积累，激活肝脏自然杀伤T淋巴细胞，加重Con A诱导的肝损伤^［18］。有研究^［19］指出，肠道菌群可能通过抗原交叉反应调节肝脏Foxp3⁺T淋巴细胞的产生，后者与AIH的炎症程度相关。而微生物的组成又受到胸腺T淋巴细胞库的影响，故胸腺T淋巴细胞库与肠道菌群相互作用以调节自身免疫的敏感性。肠道菌群失衡引起炎症因子释放和免疫细胞累积，可能影响T淋巴细胞对自身抗原的正确识别，使器官特异性免疫耐受状态受损，最终导致AIH。探索关键微生物群和上下游的免疫靶点，进一步明确失调的菌群种类和数量及结构特征、细胞因子通路和免疫细胞活化效应具体机制，可以为开发新的治疗方法创造平台。

4.2   肠道菌群代谢对AIH的影响

在肠道菌群介导宿主免疫反应的过程中，其代谢功能发挥了重要的作用。外源性膳食成分经肠道菌群发酵转化成神经递质、支链氨基酸、短链脂肪酸、维生素等代谢产物，从肝脏运输至全身其他器官或组织中发挥相应的作用。不仅如此，肠道上皮细胞与微生物代谢产物的相互作用可能会影响宿主的免疫反应与疾病进程。

肠道中的碳水化合物经过微生物发酵后产生乙酸、丁酸和丙酸等短链脂肪酸，具有调节免疫细胞的作用，与疾病有密切联系^［20］。有研究^［21-22］通过对粪便进行检测，发现AIH小鼠模型的短链脂肪酸含量低于健康小鼠，补充短链脂肪酸有利于缓解AIH疾病进展。丙酸盐和丁酸盐能增加辅助性T淋巴细胞（Th）17、Th1的数量和调节性T淋巴细胞（Treg）种群的范围，减少IFN-γ的产生^［23］。研究^［24］显示，补充丁酸钠可显著增强AIH小鼠模型的肠道屏障功能，降低血清转氨酶水平，调节免疫细胞Treg/Th17比值，从而减轻小鼠AIH的发展。其机制可能与调节Toll样受体4信号通路和炎症细胞因子如IL-6、TNF-α有关^［25］。丁酸甲酯是丁酸的酯形式之一，具有更高的口服生物利用度，可以下调AIH小鼠肝脏Th1细胞相关趋化因子的表达，抑制Toll样受体信号通路，预防Con A诱导的肝损伤^［26］。然而，与上述丁酸盐对AIH的改善作用不同，有研究^［27］发现，AIH患者的肠道中丁酸产生菌比例较健康人群增加，代谢产物中丁酸盐显著升高。这些结果表明，丁酸盐可能在AIH中发挥双重作用，即在低浓度时维持肠道屏障的稳定性，高浓度时通过诱导上皮细胞凋亡破坏肠道屏障功能^［27］。但高浓度的丁酸盐或短链脂肪酸浓度水平对AIH的疾病分层是否具有利用价值、能否通过调整不同菌群数量或比例、调节短链脂肪酸浓度水平从而辅助AIH治疗值得进一步研究讨论。

Ma等^［28］研究显示，胆汁酸经细菌代谢为次级胆汁酸，共培养小鼠重塑肠道菌群发现胆汁酸的分布和含量、基因表达均受到影响，提示肠道菌群和胆汁酸之间的作用是双向的。胆汁酸通过激活不同的胆汁酸受体，如法尼醇X受体（FXR）、G蛋白偶联受体1（GPCR-1）、孕烷X受体（PXR）等，影响人体代谢和免疫功能。小鼠FXR、PXR的激活可以减轻Con A诱导的AIH模型中的肝损伤^［29-30］。此外，胆汁酸也是调节肠道屏障功能、微生物群组成和肠道免疫反应的主要介质^［31］。但是目前为止，尚未有研究指出胆汁酸与肠道微生态以及AIH三者之间的相互作用，胆汁酸是否能成为调节肠道微生物和AIH的新靶点值得积极探索。肠源性5-羟色胺（5-HT）占全身5-HT含量超过90%，约50%的肠源性5-HT由肠道微生物群调节^［32］，AIH患者微生物群中色氨酸代谢增加^{［13，27］}。在PBC、炎症性肠病等自身免疫性疾病中发现了5-HT的参与。虽然目前尚未有报道直接提出5-HT与AIH的相互作用，但是有研究^［33］发现，米氮平（一种5-HT受体拮抗剂）通过减弱AIH小鼠的肝脏固有免疫反应，减轻肝脏炎症改变。代谢组学的发展为疾病研究提供了全新的视角，利用代谢组学指导探究AIH与肠道菌群之间的关系也许是不错的选择。除此之外，肠道菌群促进多巴胺的产生，多巴胺通过激活cAMP-PKA途径保持肝脏的免疫耐受从而抑制肝损伤^［34］。提示肠道中可能存在微生物间的相互制衡：某些菌株积极调节多巴胺的合成，其他菌株则相反，当平衡被打破时，就出现不同的疾病进展。但这种微生物-多巴胺-AIH调节轴还有待进一步证实。

4.3   肠道屏障功能对AIH的影响

肠道屏障包括上皮、黏液、免疫和微生物屏障，任何一个环节失效都可能导致AIH的发生和发展。肠道通过门静脉循环对肝脏产生影响，肝脏也通过胆管和循环与肠道相通。因此，肠道屏障受损与肝损伤之间存在着千丝万缕的联系。在AIH小鼠模型中观察到肠道绒毛变短、稀少且不规则，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1表达明显减少，提示肠道屏障被破坏^［24-25］。AIH进展早期即可出现肠道屏障受损伴通透性增加，在肠道菌群的参与下，RIP3介导的肝巨噬细胞活化和浸润加剧了小鼠的肝损伤^［35］。IgA在肠道黏膜免疫和维持肠道内环境稳定中发挥关键作用，具有抑制或杀灭细菌、中和毒素、调节肠道菌群定植和生长等作用。由聚合免疫球蛋白受体（PlgR）介导的免疫球蛋白转胞作用是黏膜免疫的重要组成部分。有研究^［36］发现肠道PlgR是AIH的关键调节因子，PlgR缺乏会降低肠道分泌型免疫球蛋白A（SIgA）水平，增加肠道屏障功能障碍，与随后发生的肝损伤密切相关。健康肠道内的菌群发挥协同共生关系维持肠道屏障，而AIH患者肠道菌群失调导致肠道屏障破坏，细菌发生易位，患者血浆内毒素水平较健康对照组明显升高，且升高程度与疾病严重性显著相关^［37］。“肠-肝轴”学说为肠道菌群和AIH的研究奠定了一定基础，肠道屏障受损从结构和功能上影响肝脏的免疫、炎症应答，换言之，维持肠道屏障稳定性对AIH患者临床转归具有积极作用。

5.   肠道微生态相关治疗方案的探索

目前，非特异性免疫抑制剂是AIH最主要的治疗方式，但药物不良反应限制了其在临床上更好地应用。如果AIH患者没有得到及时有效的治疗，可能会进一步进展至肝硬化、肝癌或者出现急性肝衰竭等不良预后。因此，通过研究肠道菌群在AIH发病机制中的作用，从而探索新的特异性治疗AIH的药物具有重大意义。

5.1   益生菌或益生元

一方面，单独补充益生菌有助于AIH的治疗，例如补充双歧杆菌可增加AIH小鼠肠道中的短链脂肪酸，尤其是丁酸盐的含量，减轻肝脏炎症并降低小鼠肝酶水平^［22］。另一方面，激素治疗AIH过程中联合使用益生菌具有改善疗效的作用。Ma等^［38］研究结果显示，乳酸杆菌胶囊增加了AIH患者中脆弱拟杆菌、梭状芽孢杆菌、轻梭状芽孢杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌含量，并显著降低了接受强的松治疗的AIH患者血清中转氨酶、自身抗体和免疫球蛋白水平。此外，强的松+乳酸菌对二胺氧化酶和内毒素水平的影响较强的松更显著，表明乳酸菌改变肠道微生物组成可能会改善强的松对AIH的治疗效果。Liu等^［21］研究结果显示，含有双歧杆菌和乳酸杆菌的复合益生菌将AIH小鼠模型的肠道优势细菌从厚壁菌门转变为拟杆菌门，减少了有害细菌的数量；还可改善肠道屏障功能，有效阻断肠源性脂多糖易位至肝脏，在减轻肝脏病理损伤方面显示出与地塞米松相同甚至更优的效果。不同于地塞米松的免疫抑制，益生菌明显存在着免疫调节作用。还有研究^［39］发现，益生菌和益生元联合使用（合生元）能够明显缓解Con A诱导的急性肝损伤，效果优于单独使用益生菌或益生元。

5.2   粪菌移植（fecal microbiota transplantation， FMT）

FMT是将分离提取自健康人粪便的菌群转移至受者肠道内，调节或改善受者的肠道菌群以达到治疗目的。根据已有的文献报道，FMT目前可用于治疗部分感染性、自身免疫性、代谢性疾病等。有研究^［40］显示，AIH小鼠模型接受FMT治疗后，血清中的肝酶水平明显下降，高丙种球蛋白血症显著好转。迄今为止未检索到FMT应用于AIH患者的相关数据，其疗效亟待有关临床研究的验证。

5.3   噬菌体

肠道微生物除细菌和真菌外，还存在着大量病毒。噬菌体是肠道病毒最重要的组成部分，通过裂解细菌宿主或改变其生理功能调节肠道菌群，被认为是微生物群落结构和功能的主要驱动力之一^［41］。自身免疫性疾病患者的肠道中噬菌体丰度明显减少，且不同自身免疫性疾病的患者噬菌体丰度降低程度不同^［42］。基于宿主细菌-噬菌体相关性的信息，对细菌特异性噬菌体进行筛选，鉴定新的抗菌酶，可以为开发针对肠道病原体的噬菌体疗法提供关键信息。

5.4   肠道屏障调节

单宁酸明胶可作为肠道屏障增强剂，通过恢复肠道通透性、肠道黏膜黏液层的完整性和调节微生物区系组成来重建肠道内环境平衡^［43］。除单宁酸明胶外，钩吻素亦具有改善肠道黏液屏障的作用。钩吻素是吲哚类生物碱，其结构与糖部分相似，可抑制糖苷酶从而保护肠道黏液屏障^［44］；此外，还可以改善肠绒毛形态，剂量依赖性地调节肠道菌群，对Con A诱导的AIH小鼠具有保护作用^［45］。但以上研究均停留在动物实验阶段，并且鲜有报道肠道黏膜保护剂在AIH中的应用，因此该措施的临床疗效有待进一步确定。

6.   小结与展望

越来越多的研究关注到AIH与肠道微生态的密切关系，然而，肠道微生态失调与AIH发生发展的因果关系仍需进一步明确。值得注意的是，目前针对AIH特异性的肠道菌群相关生物标志物相对缺乏，调节AIH患者肠道微生态的干预措施在临床研究中也较为缺乏。综上所述，进一步寻找宿主与肠道微生态的相互作用或因果关系，深入探索内在机制，可以为阐明AIH的机制通路开发更多可能性，从而为AIH的诊断和治疗发掘新的靶点。