Value of a risk assessment model in predicting venous thromboembolism in patients with liver failure after artificial liver support therapy

根据世界卫生组织最新全球调查研究^［1］，2020年全球5岁以下儿童HBsAg感染率为0.94%，每年新增HBV感染人口150万，每年死于乙型肝炎及其并发症约82万。2016年，世界卫生组织制定了全球性战略目标，旨在2030年之前消除病毒性肝炎这一全球性公共卫生威胁，将新发感染人数降低90%，死亡率降低65%^［2］。中国感染HBV的患者高达7 000万，这给中国完成2030年消除乙型肝炎的任务带来了严峻挑战。中国的HBV感染主要通过母婴传播途径，往往伴随着一个持续时间较长的免疫耐受期，表现以ALT水平持续正常为特征^［3］。多项回顾性研究及荟萃分析^［4］结果表明，ALT水平持续正常患者的肝组织并不总是完全“正常”的，有40.0%～70.0%的肝组织已经出现显著的炎症坏死（G≥2）或纤维化（S≥2），部分甚至隐匿发展为肝硬化、肝细胞癌。

血清HBV DNA定量是评估HBV复制强度最主要的指标，用于评估疾病病程、确定抗病毒时机、判断疗效及预后等多种用途。1996年德国科学家Köck^［5］在人体外周血清中发现HBV RNA。HBV RNA的本质是肝细胞核内闭合环状DNA（cccDNA）未经逆转录的前基因组RNA（pgRNA），未能有效地转录成松弛环状DNA（rcDNA），而是以病毒样颗粒的形式释放进入血液循环，最终形成“HBV RNA病毒样颗粒”^［6-9］。不同于HBsAg水平受cccDNA的转录和翻译及宿主基因的HBV DNA转录的影响^［10］，HBV RNA是cccDNA模板的直接下游产物，能更准确地反映核cccDNA库，尤其在已使用抗病毒治疗的患者中。对已使用抗病毒治疗的人群有研究^［11］显示血清HBV RNA与肝组织病变程度及疾病进展均有关，而与未经治疗患者无关^［12］。本研究旨在对不同正常水平ALT的CHB患者的肝组织病理与血清学指标相关性进行分析，为指导抗病毒药物使用的启动时机提供进一步依据。

1.   资料与方法

1.1   研究对象

收集2018年4月—2021年6月就诊于无锡市第五人民医院ALT水平正常的CHB患者的临床资料。所有血清学标本均收集于肝活检前。筛选标准：HBsAg阳性、HBV DNA阳性，血清AST、ALT水平持续正常（1年内持续随访3次，每次至少间隔3个月）。排除标准：既往抗HBV治疗史；合并其他病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝病、结缔组织病、药物性肝损伤、遗传代谢性疾病、累及全身系统性疾病等；明确肝硬化患者；妊娠患者；合并有血液系统疾病、恶性肿瘤等；合并HIV感染者。

1.2   HBV RNA的检测

由上海仁度生物科技股份有限公司提供血清HBV-pgRNA定量检测。使用HBV RNA实时荧光核酸恒温扩增法（simultaneous amplification and testing，SAT）试剂盒HBV-SAT kit（Shanghai Rendu Biotechnology Co.，Ltd，China）在AutoSAT全自动核酸检测分析系统上进行检测。具体操作按照AutoSAT仪器和试剂说明书进行。检测范围10²～10⁸拷贝/mL，检测下限为50拷贝/mL。

1.3   肝穿刺活检

所有患者进行肝穿刺活检前完善血常规、凝血功能、腹部超声等常规检查，排除穿刺禁忌证，签署肝穿刺活检知情同意书。患者去枕平卧位，手上抬平放至头部上方，B超引导下进行肝穿刺部位定位，对穿刺部位进行消毒，操作者戴无菌手套，铺巾，局部浸润麻醉，嘱患者配合呼吸，在B超引导下使用一次性全自动肝活体组织检查获得肝组织2条，置于4%甲醛溶液中进行组织固定，后续进行脱水、石蜡包埋、切片。肝组织分别予以HE染色、网状纤维染色、Masson染色、免疫组化染色（HBsAg和HBcAg）。

1.4   肝组织病理学诊断

采用我国新修订的慢性肝炎的病理学诊断标准^［13］。将肝脏炎症活动程度≥G2定义为显著性炎症，纤维化程度≥S2定义为显著性纤维化。收集肝组织内HBsAg、HBcAg的免疫组化结果、肝脏炎症活动程度、肝纤维化分期及有无合并肝脂肪变性。

1.5   统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计数资料组间比较采用χ²检验。采用Speraman秩相关进行相关性分析。采用Logistic回归进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   一般资料

本研究共纳入137例CHB患者。其中男71例（51.8%），女66例（48.2%）。ALT≤20 U/L 47例，20～29 U/L 58例，30～40 U/L 32例。处于免疫耐受期6例（4.4%），处于免疫清除期0例，处于免疫控制期25例（18.2%），处于再活动期2例（1.5%），处于不确定期104例（75.9%）。

2.2   肝组织病理检查结果

CHB患者肝穿刺结果见表1。炎症活动程度分级以G2级（n=69，50.4%）为主，≥G2级82例（59.9%）；肝纤维化分期以S0～1期（n=47，34.3%）、S2期（n=47，34.3%）为主，≥S2期90例（65.7%）。ALT≤20 U/L、20～29 U/L、30～40 U/L组分别有57.4%、53.4%、75%的患者发生显著炎症坏死（≥G2），63.8%、62.1%、75%发生显著纤维化（≥S2）。

表  1  肝组织病理学炎症活动程度分级、纤维化分期情况

Table  1.  The result of liver Liver histopathology inflammation grading， fibrosis staging

炎症活动程度分级	例（%）	纤维化分期	例（%）
G0～1	55（40.1）	S0～1	47（34.3）
G2	69（50.4）	S2	47（34.3）
G3	13（9.5）	S3	22（16.1）
G4	0（0.0）	S4	21（15.3）

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2.3   临床资料与炎症活动程度分级和纤维化分期的关系

HBeAg阳性患者的炎症活动程度分级、肝纤维化分期与HBeAg阴性患者之间差异均有统计学意义（P值均<0.05）；不同水平的血清HBV DNA组间炎症活动程度分级差异有统计学意义（P<0.05），而纤维化程度差异无统计学意义（P=0.05）；不同水平的血清HBV RNA组间炎症活动程度分级、纤维化分期差异均有统计学意义（P值均<0.05）。不同年龄、不同ALT水平的炎症活动程度分级及纤维化分期差异均无统计学意义（P值均>0.05）（表2）。

表  2  临床资料与炎症活动程度分级、纤维化分期的关系

Table  2.  Relationship of clinical data to inflammation grading and fibrosis staging

因素	例数	炎症活动程度分级			χ2值	P值	肝纤维化分期			χ2值	P值
		G0～G1	G2	G3～G4			S0～S1	S2	S3～4
年龄					1.814	0.404				0.711	0.701
<30岁	8	4	4	0			2	4	2
30～39岁	38	17	19	2			13	17	8
≥40岁	91	34	46	11			32	26	33
ALT					4.858	0.088				4.755	0.093
<20 U/L	47	20	23	4			17	22	8
20～29 U/L	58	27	27	4			22	16	20
30～40 U/L	32	8	19	5			8	9	15
血清HBeAg					10.008	0.040				7.996	0.046
阳性	28	8	12	8			10	6	12
阴性	109	47	57	5			37	41	31
血清HBV DNA					6.911	0.032				5.910	0.050
<104 IU/mL	96	44	44	8			37	32	27
104～<107 IU/mL	22	3	16	3			2	17	3
≥107 IU/mL	19	8	9	2			8	6	5
血清HBV RNA					7.946	0.019				10.874	0.012
<104拷贝/mL	96	45	45	6			39	34	23
≥104拷贝/mL	41	10	24	7			8	13	20

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2.4   相关性分析结果

CHB患者的炎症分级与肝纤维化分期之间存在相关性（r_s =0.732，P<0.05）。HBeAg阳性与血清HBV DNA、血清HBV RNA均呈现出正相关性（r_s =0.513，P=0.006；r_s =0.800，P<0.001）。血清HBV DNA水平与炎症活动程度分级、纤维化分期之间无相关性（r_s =0.024，P=0.785；r_s =0.039，P=0.652）。血清HBV RNA与炎症活动程度分级、纤维化分期之间存在显著相关性（r_s =0.222，P=0.009；r_s =0.187，P=0.029）。血清HBV DNA与血清HBV RNA间无相关性（P=0.050）。

2.5   多因素Logistic回归分析

将ALT、HBeAg、HBV DNA、HBV RNA血清学指标纳入多因素Logistic回归分析，结果提示HBeAg阳性是ALT水平正常的CHB患者肝脏发生炎症坏死（OR=-0.302，95%CI：-1.160～0.386，P=0.002）及纤维化（OR=-0.387，95%CI：-1.160～0.386，P=0.011）的独立危险因素。

3.   讨论

HBV感染约95%发生在婴儿期和幼儿期，相比之下仅有不到5%在成年后感染^［14］。国内外指南将CHB感染过程分为4个阶段：HBeAg阳性慢性HBV感染（又称免疫耐受期、慢性HBV携带状态）、HBeAg阳性CHB（又称免疫清除期、免疫活动期）、HBeAg阴性慢性HBV感染（又称非活动期、免疫控制期、非活动性HBsAg携带状态）和HBeAg阴性CHB（又称再活动期）。然而临床上存在ALT水平正常、HBV DNA高水平、HBeAg阳性，看似属于HBeAg阳性的慢性HBV携带状态，即免疫耐受期，但其肝组织已出现明显炎症坏死或纤维化，根据血清HBV DNA及ALT水平难以明确感染分期，2016年和2018年美国肝病学会（AASLD）CHB指南^［15-16］将这一情况称为不确定的“灰色地区”。2021年新加坡的一项大队列研究^［17］对处于不确定期未经治疗的非肝硬化的CHB患者进行了平均约12.5年的长期随访，结果显示约有40%患者处于不确定期，持续处于不确定期CHB患者的肝细胞癌风险比不活跃期的CHB患者高14倍，表明不确定期的患者疾病进展风险极大，需要进一步评估抗病毒治疗的时机。中国《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》^［18］新增“不确定期”，这部分患者占CHB患者的28%～55%。而本研究纳入的137例ALT水平正常的CHB患者中，75%处于不确定期，65.7%已达到抗病毒指证，比既往研究结果高，因本研究纳入人群为ALT水平正常的CHB患者，其血清HBV DNA、肝脏病理并不完全一致，致使难以明确分期的患者比例较高。

ALT作为肝细胞受损时最灵敏的肝酶指标，其升高通常被作为抗病毒治疗的指征之一。本研究显示ALT水平正常的CHB患者的肝组织约59.9%显著炎症坏死，65.7%显著纤维化。进一步将ALT分为不同正常水平研究，结果显示不同正常水平ALT组间炎症活动程度和纤维化程度无明显差异。纪林秀等^［19］对ALT水平正常及轻度升高的CHB患者的肝组织活检研究显示，随着ALT水平升高，肝组织的炎症坏死及纤维化程度均加重，这与本研究结果不同，可能因为随着HBV感染的进展，ALT水平逐渐升高，病毒复制引起的免疫反应对肝细胞的损害及炎症坏死逐渐加重，而炎症坏死持续存在或反复出现是慢性HBV感染者病情进展为肝硬化甚至肝癌的重要因素。但若病毒的免疫反应仅引起炎症和纤维化，而未损伤肝细胞，此时位于肝细胞质内的酶未释放入血，血清ALT可处于正常水平。因此，血清ALT水平不能完全准确反映HBV感染者肝脏的病理改变，且其水平受到多种因素的影响。

本研究显示ALT水平正常的CHB患者的肝脏炎症活动程度分级与纤维化分期之间存在正相关性，随着炎症程度的升高，纤维化程度越严重。ALT水平完全正常时，HBV长期感染使得肝脏反复出现炎症活动，持续不断的炎症活动持续刺激肝星状细胞活化、增殖，使得细胞外基质增生、沉积，导致肝组织内纤维化的程度逐渐升高。

HBV复制周期中，闭合环状DNA（cccDNA）作为乙型肝炎周期的中心，血清HBV DNA定量直接反映cccDNA的水平，即HBV的复制水平^［20］。本研究显示不同血清HBV DNA定量与炎症分级、纤维化分期之间均无相关性，这与周旋等^［21］的研究结果一致。周保仓等^［22］研究显示血清HBV DNA与肝脏炎症等级呈正相关，与纤维化分期无相关性。上述结果存在一定差异的原因可能是慢性HBV感染是动态活动过程，是病毒和宿主免疫系统相互作用的结果，随着感染时间的增加，病毒在体内的拷贝数呈现指数级增长，且HBV cccDNA在肝细胞核中复制转录后，病毒基因组包裹在细胞质的衣壳中，逃避宿主的免疫监视^［23］，机体的免疫应答未能应对或出现免疫耐受，致血清HBV DNA与肝组织改变间无相关性。

血清HBV RNA作为慢性HBV感染的新型标志物，目前研究主要集中于抗病毒治疗后的变化。本研究对未经治疗且ALT水平正常的CHB患者研究显示，血清HBV RNA与肝脏炎症程度及纤维化分期之间存在正相关性（P值均<0.05），这与Liu等^［24］的研究一致。Bai等^［25］研究显示pgRNA病毒粒子的包膜蛋白结构与HBV DNA病毒粒子相似，且细胞外HBV RNA具有作为合成病毒DNA模板的能力，细胞外HBV pgRNA病毒粒子可能具有感染性，使得肝组织内持续的病毒感染、复制，持续的炎症反应导致肝组织发生病变，炎症坏死及纤维化程度逐渐升高。

本研究还发现血清HBV RNA与血清HBV DNA无相关性。这可能与HBV在肝细胞内的复制过程有关。cccDNA下游的pgRNA有两种去路，其一是被衣壳内的聚合酶通过逆转录将pgRNA转化为rcDNA，再被病毒蛋白（HBsAg脂蛋白外膜）包裹成一个新的完整的HBV释放到细胞外或进入细胞核内补充cccDNA池；其二是由HBcAg组成的核衣壳包裹，形成HBV RNA病毒颗粒并通过多种途径出胞，最终进入外周血中。同时，病毒粒子出胞途径有多种，血清HBV DNA病毒粒子是通过天然内体分选复合体（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）依赖性多泡体途径输出^［26］，研究报道裸衣壳的输出是由ESCRT-0成分（肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物）和ESCRT-Ⅲ结合蛋白Alix辅助的，是完整的独立于ESCRT通路。肝细胞中是否存在裸衣壳分泌途径仍有待确定。另一方面，CHB患者血液中的一些裸衣壳可能直接来源于肝脏炎症过程中凋亡的HBV阳性细胞，而不依赖于上述途径。也有可能一些循环衣壳直接从受损的（破碎的）病毒粒子中释放^［27］。这些不同的释放路径都会影响血清HBV RNA在外周血中的定量。

本研究多因素Logistic回归分析显示，HBeAg阳性是CHB患者肝组织发生炎症坏死及纤维化的独立危险因素，与Bai等^［28］研究结果一致，且随着HBeAg的升高，血清HBV DNA、HBV RNA逐渐升高。HBeAg阳性提示HBV复制活跃，传染性强，复制过程产物均升高，肝组织出现炎症及纤维化。

总之，ALT水平正常的HBV感染者存在不同程度的显著炎症坏死及纤维化，且不同正常水平ALT的CHB患者间无明显差异，HBeAg阳性是这类患者肝组织出现显著炎症坏死及纤维化的独立危险因素。同时血清HBV RNA与肝脏炎症坏死及纤维化程度呈正相关，这使其可以作为ALT水平正常的CHB人群一个潜在的血清学指标，其临床适用性待进一步验证。对于此类患者的抗病毒治疗需结合年龄、家族史、血清HBV DNA等综合评估的基础上，提高肝穿刺活检的普及性及必要性，更及时明确抗病毒治疗的启动时机，以免延误最佳治疗时机，及时抑制病毒复制，延缓疾病发展。但本研究样本量较小，且来源于单中心，需大规模和多中心队列进一步研究未经治疗的CHB患者的血清HBV RNA，提供更多的循证医学证据。