α/β干扰素共用Ⅰ型受体，该受体有α、β两个亚单位，分别称为IFNAR1和IFNAR2^［1-4］。中国旱獭是研究HBV感染的重要动物模型^［5-6］。本研究对中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基（marmata himalayana type ‍Ⅰ interferon receptor ‍β subunit，mhIFNAR2）进行了克隆、表达和抗体制备，并在体外用siRNA鉴定其功能，为研究干扰素抗土拨鼠肝炎病毒的确切机制、土拨鼠肝炎病毒持续感染的原因及提高干扰素的疗效奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   材料

HepG2细胞、DH5α、BHK细胞、脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）由同济医学院附属协和医院感染科实验室保存；WH12-6细胞由德国埃森大学陆蒙吉教授提供；pSUPER由美国Baylor大学细胞生物学系冯新华教授惠赠；引物和RNAi由上海英俊公司合成；限制性内切酶Pst ‍Ⅰ‍、EcoR Ⅰ、Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ、pMD18T载体、DL2000、T4 DNA连接酶、T4多核苷酸激酶购自Takara公司；Trizol、Lipofectamine2000^TM购自Invitrogen公司；质粒抽提试剂盒为北京博大泰克生物基因技术有限公司生产；Taq酶和胶回收试剂盒为Tiangen公司产品；dNTP由上海凌飞公司提供；DMEM由HyClone公司提供；M-MLV逆转录酶、RNasin由美国Promega公司提供；小牛血清购自杭州四季青公司；凝胶成像分析系统购自美国UVP公司。根据其他哺乳动物干扰素受体的保守性设计引物，由上海英俊公司合成，其他哺乳动物在GenBank中的序列号分别为：鼠NM_010509，牛NM_174553，羊NM_001009342，人NM_207585（表1）。RT-PCR扩增目的基因mhIFNAR2_{（50-181aa）}。

表  1  干扰素受体β亚基的引物序列

Table  1.  Primer sequences for interferon receptor β subunit

名称	序列	核苷酸 位点
mhIFNAR1-2s	5′-AGTACATTTAGAAGCTGAAG-3'	396～416
mhIFNAR1-2as	5'-CTCTTCAGACCAAAAAGATG-3'	943～963
mhIFNAR2-1s	5'-CCATCTTATCATGGGAATTA-3'	149～169
mhIFNAR2-1as	5'-CTCTCAAAAACACAGAGTT-3'	1 281～1 300

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1.2   方法

1.2.1   mhIFNAR2的克隆

根据其他哺乳动物干扰素受体的保守序列设计引物，克隆具体步骤见文献［7］。

1.2.2   Ⅰ型干扰素受体β亚基的表达及多克隆抗体的制备

测定重组质粒pRSET-B.mhIFNAR2核酸序列；重组质粒pRSET-B.mhIFNAR2转化高效表达菌Rossetta （DE3）plysS；菌体总蛋白的Western Blot分析：转膜后利用兔抗His-probe（H-15）作为‍一‍抗，HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗进行Western Blot检测目的蛋白的表达；融合蛋白的大量制备及纯化：取纯化蛋白液20 μL，加2×蛋白电泳上样缓冲液20 μL于管中，100 ℃煮沸5 min。SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化效果；检测蛋白纯度：将目的蛋白表达过程中的各个组分进行SDS-PAGE电泳，结果进行蛋白条带灰度扫描，并用Gelwork 1D advanced V4.01软件分析。检测蛋白浓度：通常每次纯化的样本都要行SDS-PAGE检测纯化样本的纯度，高纯度的样本被收集起来，用标准的Bradford法（考马斯亮蓝G-250法）测定蛋白浓度，为下一步免疫动物作准备。以纯化的重组蛋白mhIFNAR2B_{（50-181aa）}为免疫原，每次取120 μg溶于1 mL PBS中，再与等体积的氢氧化铝佐剂混合，按40 μg/只的抗原剂量，分别免疫3只BALB/c小鼠，颈背部皮下多点注射。第14天和第28天时各加强免疫一次，加强免疫的方法和抗原剂量同上。第35天摘小鼠眼球取血，静置离心后分离血清。

1.2.3   多克隆抗体特异性鉴定

外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cell，PBMC）来源于中国旱獭，其分离的步骤如下：1 mL抗凝全血加入等体积的PBS混匀；将步骤1中的稀释全血用滴管沿管壁缓慢叠加在另一个装有2 mL的淋巴细胞分离液离心管内，注意保持清楚界面；2 500 r/min，离心20 min，管内液体分三层（从下至上为红色细胞层、分离液层、血浆层）。上层与中间层有一白色云雾状狭窄带，包括淋巴细胞、单核细胞、血小板；抽吸云雾层至灭菌管中，加入5倍体积以上的灭菌PBS（或D-Hank’s），2 000 r/min，离心5 min，弃上清；加入5倍体积以上的灭菌PBS（或D-Hank’s），2 000 r/min，离心5 min，弃上清；加入含10%小牛血清的RPMI1640 500 μL重悬细胞，每张APES处理的玻片上滴加100 μL，自然风干后用冰丙酮固定30 min行免疫组化及免疫荧光检测。用Western Blot检测其滴度。

1.2.4   mhIFNAR2功能的初步鉴定

1.2.4.1   中国旱獭α干扰素的制备

将生长状态良好的BHK细胞接种到6孔板内；生长24 h后，细胞长满至80%～90%；溶液A：2.5 μg质粒+Optim无血清培养基，总体积为100 μL；溶液B：5 μL Lipofectamine2000+95 μL Optim无血清培养基；两者室温放置5 min；混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置25 min；期间用无菌D-hank’s及培养基洗细胞两次，并加入1 600 μL无血清培养基；溶液A+溶液B内加入200 μL Optim无血清培养基，轻柔混匀后加入培养细胞孔内；37 ℃孵育5 h；换用完全培养基2.0 mL培养48 h后收获培养上清液，分装后冻存于-70 ℃，待测干扰素生物学活性。

1.2.4.2   EMCV感染滴度的测定

将生长在培养瓶内的WH12-6细胞消化后加入Ham’s-12培养基，轻轻吹打分散细胞后转种到96孔板内，100 μL/孔；待细胞在96孔板内长成单层后倾去培养液，滴定不同浓度的EMCV到细胞孔内，从原液逐渐至10^-10，呈10倍系列稀释，100 μL/孔，同时做细胞阴性对照，每个梯度接种4孔细胞，第2天观察细胞生长状况，计数不同稀释度出现细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）孔数，然后按Reed-Muench法计算半数组织培养感染剂量（TCID50）。

1.2.4.3   中国旱獭干扰素α效价的确定

将生长在培养瓶中的WH12-6细胞消化后加入Ham’s-12培养基，轻轻吹打分散细胞转种到96孔细胞培养板内；待细胞在96孔板内长成单层后倾去培养液，加入不同4倍系列稀释的BHK细胞转染上清100 μL/孔，每个稀释度有4个细胞孔，继续培养24 h，加入0.1 mL EMCV，继续培养24 h，以保护50%细胞不出现CPE的BHK细胞转染上清液最高稀释度作为干扰素效价。

1.2.4.4   siRNA干扰实验

WH12-6细胞培养于含10% FBS的Ham’s-12培养基中，于5% CO₂、饱和湿度及37 ℃条件下培养。勿使细胞融合度>90%以防止细胞老化。siRNA由广州锐博公司提供合成，序列见表2。另外设计一条阴性对照序列，Blast验证为任何物种的无关序列。

表  2  mhIFNAR2 siRNA 模板序列

Table  2.  Template of mhIFNAR2 siRNA

cDNA	正义链（5′-3′）	反义链（3′-5′）
GAAGTAGCTCTCAGAACTA（mhIFNAR1B840B）	GAAGUAGCUCUCAGAACUAdTdT	dTdTCUUCAUCGAGAGUCUUGAU
GCTTTACAGACCACATTAA（mhIFNAR2B277B）	GCUUUACAGACCACAUUAAdTdT	dTdTCGAAAUGUCUGGUGUAAUU
GCTGAAGATAAGGCAATAA（mhIFNAR1B412B）	GCUGAAGAUAAGGCAAUAAdTdT	dTdTCGACUUCUAUUCCGUUAUU
阴性对照	公司未提供序列

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将正常培养于6孔板的WH12-6细胞于转染前改用无抗生素Ham’s-12培养基培养24 h。取2 μL Lipofectamine 2000加入250 μL Opti-MEM培养基，轻轻混匀。室温孵育5 min。取20 μmol/L合成siRNA，加入250 μL Opti-MEM培养基，siRNA的终浓度分10、20及50 nmol/L三个梯度，轻轻混匀，室温孵育5 min。随后将两者轻轻混合，室温孵育20 min。加入一孔细胞中，用无血清无抗生素Ham’s-12培养基定容至2 mL。于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养6 h。换为含血清、抗生素的全培养基，培养24 h后加用中国旱獭干扰素刺激（同前），24 h后加Trizol提取RNA。用Trizol提取培养的WH12-6细胞总RNA，逆转录成cDNA，使用SYBR Green嵌合荧光法进行RT-PCR扩增，反应条件为95 ℃、60 s预变性，95 ℃、15 s共40个循环，60 ℃、20 s延伸。mhIFNAR2、MxA荧光定量RT-PCR引物序列如下：mhIFNAR2（正义）ACAATCCACCGTGCCAACT，mhIFNAR2（反义）AACAGCATCGCTTTCCCTC；MxA（正义）CAGATTGTCTACTGCCAGGACCAGGT，MxA（反义）AGCCGCTCCTTCAGGAACTTC；β‍-actin（正义）TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC，β‍-actin（反义）TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG；通过标准曲线获得直线回归方程，从而得到各个目的基因mRNA的拷贝数，将其除以内参的拷贝数，然后乘以10⁴作为该目的基因的相对值。

1.3   统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料以x¯±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   mhIFNAR2的克隆、鉴定及同源性比较

RT-PCR从脾组织中扩增出149～1 300 bp的mhIFNAR2片段，并经测序证实^［7］。同源重组构建重组质粒，经PCR、酶切和测序证实，命名为pRSET-B.mhIFNAR2。mhIFNAR2_149-1300核苷酸序列与土拨鼠、人、牛、羊及小鼠的同源性分别为98.05%、72.89%、69.17%、69.76%及64.95%（图1）。

图  1  mhIFNAR2片段核苷酸组成物种同源性比较

Figure  1.  Species homology comparison of mhIFNAR2

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2.2   重组蛋白的表达

2.2.1　重组质粒核苷酸组成示意图　ATG---6×His---Pst ImhIFNAR2_50-181 TGA---B _BEcoR I

2.2.2　重组蛋白的小量诱导表达

SDS-PAGE电泳可见，pRSET-B.mhIFNAR2重组质粒经IPTG诱导后1～6 h在大肠杆菌中均有表达，且在诱导4 h时获得量最大，而空菌及空载体转化菌诱导4 h在27 kD处仅有较弱条带（图2）。

图  2  SDS-PAGE电泳分析His-mhIFNAR2蛋白的表达

Figure  2.  Expression of His-mhIFNAR2 analyzed by SDS-PAGE

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2.2.3   目的蛋白的纯化

诱导后的菌体超速离心后，经SDS-PAGE电泳发现目的蛋白大部分存在于沉淀中，且主要以包涵体的形式存在。经Ni-NTA纯化得到的目的蛋白纯度为95%，浓度约为160 μg/mL（图3）。

图  3  pRSET-B.mhIFNAR2蛋白纯化图

Figure  3.  Purification of pRSET-B.mhIFNAR2

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2.2.4   目的蛋白的Western Blot检测

抗His与纯化的重组蛋白反应，可见有特异性条带（图4）。

注： L1，中分子量的蛋白质标准；L2，mhIFNAR2多抗血清作为一抗（1∶1 000）；L3，mhIFNAR2多抗血清作为一抗（1∶10 000）；L4，正常小鼠血清作为一抗；L5，兔抗His作为一抗。

图  4  纯化的目的蛋白Western Blot检测

Figure  4.  Western Blot analysis of the activity and specificity of antisera

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2.3   制备抗体的检测

2.3.1   免疫组化检测抗mhIFNAR2多克隆抗体特异性

抗原抗体结合部位可见明显的阳性着色（图5a），mhIFNAR2抗原的分布主要呈胞质型和胞膜型。而应用正常小鼠血清作为一抗则无阳性显色（图5b）。

图  5  mhIFNAR2多克隆抗体的免疫组化结果（DAB，×400）

Figure  5.  Immunohistochemical of mhIFNAR2 polyclonal antibodies（DAB，×400）

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2.3.2   免疫荧光结果

PBMC中mhIFNAR2免疫荧光检测主要分布于细胞质和细胞膜（图6），而阴性对照则无阳性显色。

图  6  PBMC中mhIFNAR2免疫荧光检测

Figure  6.  Stained with mouse anti-mhIFNAR2 antibody by immunofluorescence in PBMC

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2.3.3   Western Blot检测

用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠后，获得了高效价的特异性多克隆抗体。经用Western Blot检测的效价为1∶1 000。

2.4   干扰素效价的测定

以保护50%的细胞不出现CPE的BHK细胞转染上清稀释度作为干扰素的效价，表3为EMCV感染滴度测定结果，本实验所测得的干扰素效价为1∶128。

表  3  EMCV感染滴度测定结果

Table  3.  Result of EMCV infection titer determination

病毒稀释	有CPE孔	无CPE孔	累计有CPE孔	累计无CPE孔	有/总和	感染百分率（%）
100	4	0	39	0	39/39	100
10-1	4	0	35	0	35/35	100
10-2	4	0	31	0	31/31	100
10-3	4	0	27	0	27/27	100
10-4	4	0	23	0	23/23	100
10-5	4	0	19	0	19/19	100
10-6	4	0	15	0	15/15	100
10-7	4	0	11	0	11/11	100
10-8	4	0	7	0	7/7	100
10-9	2	2	3	2	3/5	60
10-10	1	3	1	5	1/6	16.7

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2.5   siRNA干扰效应

起始于840位点的siRNA840对WH12-6细胞mhIFNAR2基因无明显的抑制作用（P>0.05）（图7）。起始于277位点的siRNA277（20 nmol/L）对WH12-6细胞mhIFNAR2、M×A基因有明显抑制作用，差异均具有统计学意义（P值均<0.05）（表4）。

图  7  不同浓度的siRNA840对WH12-6细胞mhIFNAR2、M×A基因的抑制作用

Figure  7.  The inhibitory effect of siRNA840 at different concentrations on mhIFNAR2 and M×A

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表  4  不同浓度的siRNA277对WH12-6细胞mhIFNAR2、M×A基因的抑制作用

Table  4.  The inhibitory effect of siRNA277 at different concentrations on mhIFNAR2 and M×A

组别	mhIFNAR2	M×A
空白对照（n=3）	11.678±0.725	3.087±1.910
阴性对照（n=3）	14.190±3.100	4.150±0.500
20 nmol/L（n=3）	2.538±0.1241）2）	1.350±0.2121）2）
注：与空白对照组比较，1）P<0.05；与阴性对照组比较，（2）P<0.05。

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3.   讨论

干扰素受体由α、β两个亚基组成，当其与干扰素结合后迅速引起TYK2、JAK1、STAT1、STAT2磷酸化，进而激活转录产生各种抗病毒蛋白。尽管干扰素发现已有50年的历史，但直到1990年才鉴定出干扰素受体由α、β两个亚基组成。其中β亚基有长、短及可溶等三种形式^［8-10］。随着干扰素与其受体相互作用、信号转导机制及生物应答研究的深入，干扰素受体在介导干扰素抗感染中的天然免疫、获得性免疫以及肿瘤中的作用逐渐引起人们的注意，干扰素受体缺失引起严重的病原体感染^［11-12］。但是，干扰素在不同的细胞中会产生相反的生物学效应。比如在大多数细胞中干扰素表现为抑制增殖，促进凋亡，却可延长记忆性T淋巴细胞的存活时间^［13-14］。因此，阐明干扰素受体复合物的功能有助于解释这些现象的原因。在乙型肝炎动物模型中阐明干扰素抗病毒的作用机制及HBV的持续性感染具有重要的临床意义。

本研究利用哺乳动物干扰素受体序列的保守区设计引物，成功地从中国旱獭脾组织中克隆出mhIFNAR2_149-1300。mhIFNAR2_149-1300核苷酸序列与土拨鼠、人、牛、羊及小鼠的同源性分别为98.05%、72.89%、69.17%、69.76%及64.95%。该结果与笔者前期克隆的中国旱獭其他分子相似^［15-18］。

干扰素是具有多种生物功能的细胞因子，其发挥效应的始动环节是与其受体结合，使胞内段发生磷酸化，激活转录从而产生各种抗病毒蛋白。本研究目的是在mhIFNAR2克隆的基础上，在体外用抗体阻断及siRNA干扰的方法进一步证实所克隆基因的正确性，了解mhIFNAR2在干扰素信号通路的作用，为在乙型肝炎动物模型中国旱獭体内实验奠定基础。

前期研究^［14］结果显示IFNAR2与干扰素结合的重要位点包括E78、W101、I104以及D105，而既往的一些研究^［19-20］也发现干扰素受体胞外段作为免疫原可以产生中和抗体。因此本文选择了mhIFNAR2_{（50-181aa）}胞外段重组蛋白作为抗原制备抗体。

本实验以胞外段mhIFNAR2重组蛋白免疫小鼠，制备了抗mhIFNAR2的多克隆抗体。对所获得的抗血清进行了Western Blot检测，证实制备的多克隆抗体特异性良好，具有免疫学活性，不仅可以识别作为免疫原的融合蛋白，还能有效识别PBMC中的mhIFNAR2蛋白。免疫组化及免疫荧光检测可见mhIFNAR2抗原的分布主要呈胞浆型和胞膜型。并且免疫血清在较高稀释浓度下即可检测到mhIFNAR2蛋白，且无明显的非特异性条带，证实了多克隆抗体的高效性和抗mhIFNAR2的特异性，为进一步研究mhIFNAR2及干扰素在乙型肝炎动物模型中的作用提供了实验基础。

本研究用该抗体进行干扰素受体封闭实验，结果显示无明显作用（具体数据未展示），原因可能有：（1）某些抗体虽然可以与其受体结合，但是不能阻断干扰素的作用，且不同干扰素型别存在差异^［21-22］；（2）不同细胞系与抗体的结合力也存在差异^［17］；（3）一些抗体并不能阻止干扰素与其受体结合^［22］。此外，本研究制备的是多克隆抗体，一是没有纯化，二是某些多克隆位点可能对干扰素信号通路产生影响。

本研究设计、合成针对中国旱獭mhIFNAR2的siRNA，并在基因水平成功验证了起始于277位点的siRNA能够有效抑制mhIFNAR2的表达，为深入研究mhIFNAR2的功能和机制，尤其是为在乙型肝炎中的研究提供了一个手段。