肝星状细胞（HSC）作为肝细胞癌（HCC）微环境中最主要的窦周细胞，在HCC的发生发展中发挥了重要作用^［1-2］。体外研究^［3-4］表明，在HSC与HCC细胞的共培养体系中，HSC通过分泌生长因子、细胞外基质蛋白和金属基质蛋白酶诱导肿瘤细胞向恶性表型转化，同时增强肝癌细胞的侵袭与迁移能力。在皮下移植异种裸鼠肝癌模型^［5］中发现，HSC通过促进HCC细胞增殖和抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤生长。研究^［6-7］还发现，HSC通过分泌血管内皮生长因子、血小板源性生长因子和转化生长因子等生长因子，促进肿瘤的血管生成。硫化氢（hydrogen sulfide， H₂S）是继一氧化碳和一氧化氮后第3种重要的内源性气体信号分子，参与氧化应激、细胞增殖与凋亡、血管扩张、血管再生、炎症等多种病理生理过程^［8］。内源性H₂S由半胱氨酸和同型半胱氨酸经胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase， CSE）、胱硫醚β-合酶（cystathionine β-synthase， CBS）及3-巯基丙酮酸转硫酶（3-mercapto-pyruvate sulphurtransferase， MPST）合成产生^［9］。前期研究^［10］发现，外源性H₂S供体——NaHS，通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导肝癌细胞自噬，从而促进了细胞凋亡，抑制细胞增殖与迁移。然而，在肝癌微环境中HSC是否通过H₂S参与调控HCC的生物学过程尚不明确。因此，本研究通过HSC与肝癌细胞系共培养，探讨HSC通过分泌H₂S参与调控肝癌细胞凋亡的作用及其机制。

1.   材料与方法

1.1   材料

DMEM细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-链霉素、CSE抑制剂——炔丙基甘氨酸（propargylglycine， PPG）及JNK/JunB抑制剂——SP600125试剂购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；H₂S检测ELISA试剂盒购自南京金益柏生物科技有限公司；RNA提取、逆转录及SYBR等RT-qPCR试剂购自宝日医生物技术（北京）有限公司；Transwell小室购自美国康宁公司；CCK-8试剂盒购自美国Abmole奥默生物公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；人源β- actin、GAPDH、JNK、JunB、p-JNK/JunB抗体和二抗、ChIP试剂盒购自美国Cell Signaling technology公司；肿瘤坏死因子超家族成员-14（tumor necrosis factor superfamily member-14，TNFSF14）多克隆抗体购于美国Affinity Biosciences公司。

1.2   细胞培养

肝星状细胞系（LX-2）及肝癌细胞系（HepG2、PLC/PRF/5），用含10%胎牛血清及1%的青霉素-链霉素混合液的DMEM培养基，置于37 ℃，5%（体积分数）CO₂恒温细胞孵育箱内培养。Transwell小室建立共培养体系，上室接种LX-2，下室接种HepG2或PLC/PRF/5，按照说明书操作。所有细胞实验重复3次。

1.3   ELISA定量测定H₂S

LX-2产生的H₂S浓度及NaHS释放的H₂S，按照说明书进行操作。在酶标板对应的孔中分别加入标品及待检测的LX-2培养上清液和NaHS，随后进行孵育和洗板，加入显色液37 ℃孵育15 min，加入终止液终止反应。酶标仪450 nm波长测定，根据标准曲线，计算所测样本中H₂S浓度。

1.4   RNA提取、二代测序及RT-q PCR

Trizol法提取总RNA。取1 μg总RNA，按照Takara逆转录试剂盒合成cDNA，SYBR Green Master Mix说明书配置20 μL RT PCR体系，ABI 7500进行RT-q PCR。所需的引物序列见表1。LX-2与HepG2共培养（LX-2共培养组）、NaHS处理HepG2（NaHS处理组）及对照组（单独HepG2培养）提取的HepG2细胞总RNA送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行转录组二代测序分析，对差异基因［以|log2（fold change）|≥1为差异表达基因的标准］进行聚类分析和Veen分析。

表  1  RT-qPCR和ChIP-PCR所需要的引物序列

Table  1.  Primers for Real-Time PCR and ChIP-PCR

项目	寡核苷酸序列
RT-qPCR引物
TNFSF14	F：5'-CGTGAGACCTTCGCTCTTGTAT-3'
	R：5'-CCCTCAGTGTTTGTGGTGGAT-3'
CSE	F：5'-AAGACGCCTCCTCACAAGGT-3'
	R：5'-ATATTCAAAACCCGAGTGCTGG-3'
GAPDH	F：5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3'
	R：5'-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3'
CBS	F：5'-AATGGTGACGCTTGGGAA-3' R：5'-TGAGGCGGATCTGTTTGA-3'
MPST	F：5'-GACCCCGCCTTCATCAAG-3' R：5'-CATGTACCACTCCACCCA-3'
ChIP-qPCR引物
TNFSF14	F：5'-TTGTTCATTGCTGCATCCCC-3'
	R：5'-CTCCTCTTCTTCCGGTACCC-3'

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1.5   蛋白提取及Western Blot （WB）检测

取LX-2共培养组及NaHS处理组的HepG2细胞，PBS清洗2次，随后在10 cm²培养皿中加入1 mL RAPI裂解液，冰上裂解20 min，转移裂解液到EP管中，4 ℃，12 000×g离心30 min，上清即为细胞总蛋白。BCA试剂盒对提取的蛋白进行定量分析，加入对应体积的蛋白上样缓冲液后置于100 ℃金属浴5 min，使蛋白变性，用于后续WB检测。SDS-PAGE胶用于分析所提取的蛋白，取20 μg蛋白上样电泳，转膜，牛奶封闭，随后加入对应的抗体4 ℃孵育过夜，将孵育好的膜放到对应的二抗中，室温孵育1 h后，加入化学发光液测定和分析。

1.6   CCK-8检测细胞活力

将生长状态良好的细胞接种在96孔板，LX-2分别与HepG2、PLC/PRF/5共培养1、2、3、4天，单独HepG2、PLC/PRF/5培养分别作为对照组。按照说明书，每孔加入10 μL CCK-8试剂，随后置于37 ℃培养箱内孵育1 h后，酶标仪450 nm测定吸光度值。细胞活力计算：细胞活力（%）=［A₄₅₀（样本－空白）］/［A₄₅₀（对照－空白）］×100%。

1.7   流式细胞术测定细胞凋亡

将处理好的细胞制备成为单细胞悬液，按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书，加入5 μL Annexin V孵育，再加入5 μL PI避光孵育，FACS流式细胞仪（BD公司）进行检测。

1.8   细胞免疫荧光染色

细胞均匀接种到已放入无菌盖玻片的24孔板中，NaHS处理HepG2细胞0、1、2、8、24 h。取处理好的细胞，加入1 mL 4%多聚甲醛固定，随后进行透膜处理，加入1% BSA稀释抗体p-JunB（1∶500），4 ℃孵育过夜。1% BSA稀释FITC标记的荧光二抗（1∶500）避光条件下，室温孵育1 h。DAPI染核及封片，荧光显微镜下采集图像，Image J软件分析目的蛋白平均免疫荧光强度。

1.9   染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation， ChIP）

LX-2分别与HepG2和PLC/PRF/5共培养，以及NaHS分别处理HepG2和PLC/PRF/5细胞后，ChIP方法测定p-JunB与TNFSF14启动子结合力。WB测定HepG2和PLC/PRF/5细胞核中p-JunB表达，应用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）对细胞核DNA染色（蓝色）和FITC标记的抗体测定细胞核p-JunB表达（绿色）。LX-2与NaHS处理后的HepG2和PLC/PRF/5细胞用4%多聚甲醛固定10 min，核酸酶将DNA特异性的消化为DNA片段，随后加入JunB、p-JunB抗体，从而特异性的富集目的蛋白质和DNA复合体，通过对复合体进行富集纯化，收集DNA用于PCR检测。

1.10   统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料以x¯±s表示，两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   LX-2通过CSE产生H₂S

LX-2培养上清液中H₂S浓度随着时间延长逐渐增加［（22.89±0.08）pg/mL vs （28.29±0.15）pg/mL vs （36.19±1.90） pg/mL，F=79.63，P<0.05］（图1a）。LX-2中CSE mRNA水平显著高于CBS mRNA和MPST mRNA（1.008±0.13 vs 0.320±0.014 vs 0.05±0.02， F=80.84，P<0.05）（图1b）。在LX-2中加入不同剂量PPG后，随着PPG浓度增加，H₂S浓度下降（P<0.05）（图1c）。PPG特异性、浓度依赖性的降低CSE mRNA及蛋白水平（图1d、e）。

注： a，LX-2细胞产生H₂S的浓度；b，CSE、CBS和MPST的mRNA在LX-2细胞中的表达倍数；c，PPG处理后LX-2产生H₂S的浓度；d，CSE的mRNA表达；e，CSE蛋白的表达水平。

图  1  LX-2通过CSE途径产生H₂S

Figure  1.  LX-2 produce H₂S mainly via the CSE

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2.2   LX-2抑制肝癌细胞活力、促进凋亡

LX-2分别与HepG2、PLC/PRF/5共培养，随着培养时间延长，HepG2（87.48%±0.82% vs 70.48%±0.641% vs 52.89%±0.57% vs 45.20%±0.69%，F=1 517.13，P<0.001）和PLC/PRF/5（92.41%± 0.48% vs 74.10%±0.73% vs 53.70%±0.60% vs 44.00%± 0.27%，F=2 626.21，P<0.001）细胞活力降低（图2a、b）；凋亡增加（HepG2：12.88%±0.64% vs 15.5%±0.16% vs 18.43%±0.37% vs 13.01%±0.58%，F=142.15，P<0.001；PLC/PRF/5：8.51±0.05 vs 12.80±0.33 vs 15.59±0.21 vs 10.72±0.30，F=676.40，P<0.001），第3天最显著（图2c、d）。

注： a，HepG2细胞活力；b，PLC/PRF/5细胞活力；c，HepG2细胞凋亡；d，PLC/PRF/5细胞凋亡。a、c，对照组为单独HepG2培养；b、d，对照组为单独PLC/PRF/5培养。与第1天比较，*P<0.05。

图  2  LX-2与肝癌细胞系共培养对肝癌细胞活力及凋亡的影响

Figure  2.  Effect of LX-2 co-culture with hepatoma cell on viability and apoptosis

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2.3   内源性和外源性H₂S调控肝癌细胞多种基因

LX-2与HepG2共培养及NaHS处理HepG2后，转录组测序显示分别上调1 047和1 183个基因，共同上调659个基因；分别下调997和1 144个基因，共同下调342个基因（图3a）。其中，30个变化最大的基因，包括TGM2、PDE2A、AQP7P1、SOCS3、B3GNT3、LGALS7B、CPNE7、TCAF2、AXL、CD3D、BEAN1、KIF26B、SLC1A7、TFF1、IGFBP3、ADAMTS16、ACTA1、SLC2A5、SERPINE2、KCNMB4、LSP1、A4GALT、TNFSF14、NPPB、MUC5B、NKAIN4、TRAF5、PFKP、EHD2、MTMR11（图3b）。选择促凋亡基因TNFSF14进行分析，与对照组相比，NaHS处理组TNFSF14基因增加约2.8倍，LX-2共培养组TNFSF14基因增加约2倍（P<0.05）（图3c）。

注： a，聚类分析；b，差异倍数值变化最大的30个差异基因；c，TNFSF14基因表达变化。对照组，单独HepG2培养。

图  3  RNA-seq分析内源性和外源性H₂S对HepG2细胞转录基因的影响

Figure  3.  RNA-seq to analyse the transcriptome of endogenous and exogenous of H₂S on HepG2

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2.4   H₂S通过激活JNK/JunB信号通路调控TNFSF14转录

ChIP实验发现，与对照组相比，NaHS处理的HepG2和PLC/PRF/5细胞中p-JunB与TNFSF14基因转录调控区域结合增加（图4a）；p-JunB定位于细胞核中，NaHS作用1 h荧光强度开始升高，8 h达到高值（图4b）；且与WB结果一致（图4c）。PPG干预后，HepG2和PLC/PRF/5胞核蛋白p-JunB表达明显下降（图4d）；经SP600125（JNK/JunB抑制剂）处理后，显示JNK/JunB-TNFSF14信号通路被抑制。NaHS处理也显示了相似结果（图4e）。延长NaHS处理时间，细胞核p-JunB表达增加，但JunB表达无明显变化。结果提示，LX-2和NaHS通过释放H₂S，激活JNK/JunB信号通路调控TNFSF14基因转录。

注： a，ChIP显示，在HepG2和PLC/PRF/5细胞中，p-JunB与TNFSF14启动子结合力增加；b，NaHS分别处理HepG2和PLC/PRF/5 0、1、2、8、24 h后，HepG2和PLC/PRF/5细胞核中p-JunB表达及核转位，DAPI（蓝色）和FITC（绿色）分别为对细胞核DNA及p-JunB进行染色；c，NaHS不同处理时间后，HepG2和PLC/PRF/5细胞核与细胞质中p-JunB的表达；d，NaHS处理组和LX-2共培养组HepG2及PLC/PRF/5细胞的p-JunB蛋白变化；e，PPG和SP600125抑制了H₂S及NaHS对HepG2与PLC/PRF/5中JNK/p-JNK、JunB/p-JunB、TNFSF14蛋白水平。

图  4  内源性H₂S和NaHS通过激活JNK/JunB信号通路调控TNFSF14转录

Figure  4.  Endogenous H₂S and NaHS upregulated TNFSF14 via JNK/JunB signaling pathway

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3.   讨论

第3个重要的内源性气体信号分子H₂S自1992年被发现，较多研究^［11-12］证实了H₂S及其合成酶的多种功能，参与了血管扩张、血管生成、炎症免疫、氧化应激和细胞凋亡与自噬的调控等过程，在肿瘤和非肿瘤性疾病，特别是心血管疾病的病理生理中具有重要作用。因此，H₂S及其合成酶可能是治疗的靶点。但是，CSE/H₂S在肝癌发生发展中的作用研究较少^［13］。由肝细胞及肝窦周细胞，包括HSC、肝窦内皮细胞、Kuffer细胞、肝癌细胞和细胞外基质等组成的复杂肿瘤微环境（tumor microenvironment， TME）中，HSC及信号分子H₂S促进肝癌细胞凋亡的机制尚未阐明^［14］。本研究发现，HSC主要通过CSE产生信号分子H₂S，激活了肝癌细胞中的JNK/JunB信号通路，上调TNFSF14基因，TNFSF14表达增加，从而促进了肝癌细胞的凋亡，发挥抗肿瘤作用。Han等^［15］发现，HepG2中TNFSF14下调Bcl-2和survivin，通过线粒体及p53独立途径，诱导肝癌细胞凋亡。体外研究^［16］表明，在HepG2和SMMC-7721细胞中，TNFSF14与LT-βR结合，激活caspase-9和caspase-3，抑制STAT3磷酸化下调Bcl-XL表达，进而诱导肝癌细胞凋亡，提示线粒体途径也是TNFSF14诱导细胞凋亡的关键因素。由此可见，TNFSF14通过线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径等，促进肝癌细胞凋亡。此外，TNFSF14还表达于免疫细胞，如活化T淋巴细胞，未成熟树突状细胞和活化自然杀伤细胞，TNFSF14信号转导对T淋巴细胞激活和诱导细胞凋亡具有重要作用^［17］。TNFSF14也通过激活抗肿瘤免疫效应，间接杀伤肿瘤细胞和触发肿瘤细胞凋亡，表现出强大的免疫抗肿瘤活性，在多种不同的肿瘤中发挥抗瘤作用^［18］。因此推测，在肝癌微环境中，H₂S通过激活肝癌细胞中凋亡基因TNFSF14表达及多种细胞凋亡信号途径，促进肝癌细胞凋亡。

TNFSF14诱导肝癌细胞凋亡的分子机制尚不清楚。本研究ChIP实验证明，无论是在HepG2还是在PLC/PRF/5中，转录因子p-JunB均可与TNFSF14基因的转录调控区域结合，且H₂S增强了p-JunB与TNFSF14基因启动子的结合能力。H₂S生成酶CSE抑制剂——PPG和p-JNK抑制剂SP600125，均显著抑制了H₂S对JNK/JunB信号通路的激活，导致TNFSF14表达降低。上述结果提示H₂S在调节肝癌细胞TNFSF14表达中具有重要作用。细胞免疫荧光和WB也证明了外源性H₂S供体NaHS及HSC合成的内源性H₂S，促进了肝癌细胞p-JunB的表达及核转位。JunB作为Jun家族的重要成员之一，是转录因子AP-1（转录激活蛋白-1）的主要成分，对各种刺激如辐射、应激及生长信号等作出生理或病理应答，参与细胞增殖与分化、转化、凋亡、炎症等过程，在肿瘤的形成、转移和侵袭中发挥重要作用^［19］。也有研究^［20］发现，JNK/JunB促进HepG2凋亡并抑制了其增殖与侵袭能力。因此，本研究首次阐明了TNFSF14启动子的转录活性受到转录因子JunB的调控，H₂S可激活转录因子JunB，促进p-JunB的核转位，进而上调肝癌细胞凋亡基因TNFSF14。CSE/H₂S可能是防治HCC具有潜力的新靶点。

总之，在TME中活化HSC合成分泌信号分子H₂S，通过激活肝癌细胞中的JNK/JunB-TNFSF14信号通路，从而促进肝癌细胞凋亡、抑制肿瘤细胞活力，可能是HSC在TME中调节肝癌细胞生物学功能的新机制之一。