肝纤维化是肝硬化的必经阶段，目前尚缺乏有效的治疗方法^［1-2］。肝纤维化发生的核心机制是肝星状细胞活化导致细胞外基质过度沉积^［3］。因此，以活化的肝星状细胞为治疗靶点，进一步探索纤维化发展和逆转的新机制具有重要意义。

成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor-inducible 14，Fn14）是肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂（TWEAK）的主要受体，TWEAK启动细胞内信号通路，如NF-κB和MAPK^［4］。Fn14具有重要的病理生理作用，参与组织损伤修复、血管生成、炎症反应、细胞存活和死亡等^［5］。本课题组先前研究以Fn14为中心，相继发现Fn14的上调通过激活经典的NF-κB/MMP9信号通路促进细胞迁移^［6］；Fn14还能抑制活化肝星状细胞的凋亡并促进炎症因子的分泌，下调Fn14则会增加细胞凋亡^［7］。本研究继续以Fn14为靶标，进一步探讨其促进纤维化的机制及可能逆转的新方法。

研究^［8-10］表明，白细胞介素（IL）22可促进活化的肝星状细胞衰老，还可通过抑制肝星状细胞的活化和下调炎症因子的表达来逆转纤维化。相反，也有研究^［11-12］表明，IL-22在HBV感染小鼠模型中具有促纤维化作用，IL-22的高表达与HCV感染患者的纤维化进展相关。这表明IL-22可能在不同的肝病中发挥不同的作用。

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是细胞为应对内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集，以及钙离子平衡紊乱等状况，而激活未折叠蛋白反应等信号途径的反应过程^［13］。ERS促进肝星状细胞活化在相关研究中被证实：ERS引起的氧化应激可促进肝星状细胞的活化^［14］；丹酚酸A通过SIRT1介导的HSF1脱乙酰化减轻ERS，从而缓解肝纤维化^［15］；在体外，用衣霉素（tunicamycin，TM）化学诱导未折叠蛋白反应可促进肝星状细胞活化^［16］。IL-22可以调节INS-1细胞中棕榈酸酯诱导的ERS^［17］；IL-22可以逆转高脂饮食诱导的结肠上皮细胞ERS的影响^［18］。但目前未见有IL-22对肝星状细胞ERS具有调控作用的研究报道。

目前的研究主要揭示Fn14促进肝纤维化的现象，对机制的研究仍有欠缺。研究发现，Fn14能够调控肝星状细胞ERS相关分子表达，同时IL-22能够抑制活化肝星状细胞Fn14的表达。本研究通过观察IL-22对肝星状细胞活化的影响，探讨可能通过Fn14调控ERS的可能机制。为临床治疗肝纤维化提供新的理论和实验依据。

1.   材料方法

1.1   细胞培养和处理

人肝星状细胞LX-2购自中国武汉普诺赛生物公司，在混合有10%胎牛血清的1640培养基中培养，温度为37 ℃，培养条件为5% CO₂加湿空气。培养基定期更换，直至细胞生长至覆盖培养瓶底部的70%～80%。然后根据不同实验需求将细胞接种到6/12孔板中，贴壁12～24 h后，根据不同分组需要予以TGF-β1 5 ng/mL、IL-22 10 ng/mL、TM 2 ug/mL、TWEAK 100 ng/mL处理，24 h后收取细胞。

1.2   试剂和抗体

胎牛血清、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶-EDTA溶液和磷酸盐缓冲液（PBS）购自南京森贝伽生物公司；IL-22（货号：HY-P7039）、TGF-β1（货号：HY-P）购自美国MCE公司；TWEAK（货号：RP01446）购自武汉爱博泰克生物公司；Tunicamycin（N-连接的糖基化抑制剂）（货号：SC0393）购自碧云天公司；Fn14 （货号：ab109365）、 p-IRE1α （货号：ab124945）、 XBP1s （货号：ab220783）、 ATF6（货号：ab227830）、 PERK（货号：ab229912）一抗购自英国Abcam公司；IRE1α（货号：A21021）购自武汉爱博泰克生物公司；α-SMA（货号：1E9A11）、COL1A1（货号：1E9A7）和β-actin（货号：4H1）购自武汉三鹰生物公司。

1.3   Fn14小干扰RNA转染

Hs-Fn14-si1、Hs-Fn14-si2、Hs-Fn14-si3和阴性对照模拟物（NC组）由上海汉恒生物公司合成。细胞转染采用Lipofectamine 2000试剂（上海赛默飞公司），按照供应商提供的方案进行。转染后48 h收取细胞进行下一步实验。

1.4   Western Blot检测

取经药物干预处理的LX-2细胞，用预冷的PBS冲洗6孔板中的LX-2细胞3次，用含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液裂解30 min，提取细胞内总蛋白，用BCA蛋白检测试剂盒（碧云天）测定总蛋白浓度。将等浓度的总蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到Immobilon^®-PSQ PVDF膜上，用甲醇激活，与 Fn14（1∶5 000）、IRE1a（1∶1 000）、p-IRE1a（1∶5 000）、XBP1s（1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）、COL1A1（1∶1 000）的一抗在4 ℃冰箱中孵育过夜。然后用HRP结合的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）或山羊抗鼠IgG二抗在室温下孵育1 h，ECL显影，曝光时间1～2 min，并使用Tanon 5200 Multi图像分析系统收集和分析印迹产物的图像。

1.5   定量实时PCR

取经药物干预处理的LX-2细胞，用预冷的PBS冲洗加药的LX-2细胞，根据生产商的说明使用TRIzol试剂从LX-2细胞中提取总RNA，并使用分光光度计进行定量。使用 HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR将1 μg RNA反转录为cDNA，然后使用qPCR Master Mix和相应引物进行实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）。目标mRNA的表达量与人β-肌动蛋白mRNA的表达量进行比较，并采用-ΔΔCt法对数据进行量化，使用GraphPad Prism 8对数据进行统计分析做图。所用引物序列见表1。

表  1  目标基因的引物序列

Table  1.  Primer sequences of target genes

基因	正向引物（5'-3'）	反向引物（5'-3'）
β-actin	GGCACCACACCTTCTACAATGAG	GGATAGCACAGCCTGGATAGCA
α-SMA	CCTGTGTTGTGGTTTACACTGG	GGGGGAATTATCTTTCCTGGTCC
COL1A1	GAGGGCCAAGACGAAGACATC	CAGATCACGTCATCGCACAAC
XBP1s	TGGATTCTGGCGGTATTGACTC	GAACTGGGTCCTTCTGGGTAGA
Fn14	GCTCTGAGCCTGACCTTCGT	TCTCTCCTGCGGCATCGT

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1.6   免疫荧光检测

在带有无菌载玻片的12孔板中培养LX-2细胞，每孔约4×10⁴个。经药物处理后，用冷PBS冲洗载玻片上的LX-2细胞3次，室温下用4%多聚甲醛固定20 min，室温下用0.5% Triton-100通透20 min，室温下用5% BSA封闭30 min，然后用稀释为1∶100的一抗孵育过夜。最后，用PBST冲洗载玻片3次，并用稀释为1∶100的FITC结合物山羊抗兔二抗在室温下孵育1 h。滴加DAPI进行再染色。然后使用Leica DMi8倒置荧光显微镜观察玻片，并存取图片。

1.7   统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。计量资料两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Sidak’s多重比较检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   IL-22对肝星状细胞活化的影响

用TGF-β1（5 ng/mL）处理LX-2细胞24 h，同时予以不同浓度的IL-22（0、1、10、50和100 ng/mL）分组处理，Western Blot结果显示，与TGF-β1组相比，随着IL-22浓度升高，其抑制α-SMA和COL1A1表达的作用越强（图1a、b）。同样用TGF-β1（5 ng/mL）诱导LX-2细胞24 h，同时用不同浓度的IL-22（0.1、0.5、1、10、100 ng/mL）分组处理，qRT-PCR结果显示，与TGF-β1组相比，IL-22处理的LX-2组中α-SMA和COL1A1的表达水平也呈剂量依赖性（图1c）。用TGF-β1（5 ng/mL）诱导LX-2细胞24 h后分别用IL-22处理12 h和24 h，对α-SMA和COL1A1 mRNA的qRT-PCR检测显示，IL-22在处理12 h和24 h均表现出抑制效应，且TGF-β1在24 h时诱导活化效应更显著（图1d）。

注： a，Western Blot分析LX-2细胞中的活化标志物α-SMA和COL1A1在梯度浓度IL-22处理条件下的表达情况；b，使用ImageJ软件对图a条带进行灰度值分析；c，qRT-PCR分析LX-2细胞中的活化标志物α-SMA和COL1A1在梯度浓度IL-22处理条件下的表达情况；d，qRT-PCR分析LX-2细胞中的活化标志物α-SMA和COL1A1在不同处理时间下的表达情况。

图  1  IL-22对肝星状细胞活化的影响

Figure  1.  Effect of IL-22 on LX-2 cells activation

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2.2   IL-22抑制肝星状细胞中Fn14的表达和ERS

按对照组、TGF-β1组、TGF-β1+IL-22组不同分组对应药物处理LX-2细胞24 h，Western Blot结果显示，TGF-β1促进Fn14及ERS相关蛋白磷酸化的IRE1α和XBP1s的表达。加入IL-22后上述蛋白表达受到抑制，而未折叠蛋白反应另外两个通路蛋白ATF6、PERK的表达不受影响（图2a），后续试验将主要聚焦于IRE1α- XBP1s信号通路。Fn14和XBP1s的免疫荧光染色结果与Western Blot和qRT-PCR结果一致（图2b～d）。为进一步研究IL-22是否通过抑制LX-2的ERS发挥作用，加入ERS诱导剂TM激活LX-2，将细胞分为对照组、TM组、TM+IL-22组。Western Blot结果显示，TM处理的LX-2中IRE1α和XBP1s的表达明显增加。此外，TM还上调了α-SMA和COL1A1的表达，IL-22处理可抑制这种现象（图2e）。qRT-PCR结果显示，XBP1、COL1A1和α-SMA的mRNA表达与Western Blot检测结果一致（图2f）。

注： a，Western Blot分析LX-2细胞经不同分组（NC、TGF-β1、TGF-β1+IL-22）处理24 h后，相关目的蛋白表达情况；b，qRT-PCR分析LX-2细胞经同a图方法处理后XBP1s、Fn14基因表达量；c、d为免疫荧光分析LX-2细胞同a图方法处理后Fn14、XBP1s表达量（×400）；e，Western Blot分析LX-2细胞经不同分组（NC、TM、TM+IL-22）处理24 h后相关目的蛋白表达情况；f，qRT-PCR分析LX-2细胞经同e图方法处理后XBP1s、COL1A1、α-SMA基因表达量。

图  2  IL-22抑制肝星状细胞中Fn14的表达和ERS

Figure  2.  IL-22 inhibits Fn14 expression and ERS in HSCs

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2.3   Fn14调控IRE1α-XBP1s信号通路

首先，使用小干扰RNA下调肝星状细胞Fn14的表达，并通过Western Blot和qRT-PCR验证其下调效率（图3a～b）。成功下调Fn14表达后，检测IRE1α-XBP1s通路的表达情况，随着Fn14的下调，XBP1s、α-SMA和COL1A1的mRNA表达均有所降低（P值均<0.01），蛋白表达的变化也一致，总的IRE1a蛋白变化不明显，但磷酸化的IRE1a减少（图3c、d），结果表明，Fn14是通过IRE1α-XBP1s途径激活肝星状细胞。为了进一步说明两者之间的关系，在先前研究的基础上，使用TWEAK上调Fn14的表达，然后检测相关蛋白的表达。将细胞分为NC组和TWEAK组，使用TWEAK处理细胞24 h后，TWEAK组Western Blot结果显示，Fn14上调后，p-IRE1α、XBP1s、α-SMA和COL1A1的表达量增加（图3e）。qRT-PCR结果显示，与对照组相比，TWEAK处理的LX-2中Fn14、XBP1s和α-SMA的mRNA表达明显增加（P值均<0.01）（图3f）。Fn14和XBP1s的免疫荧光染色结果与Western Blot和qRT-PCR结果一致（图3g）。

注： a、b，Western Blot、qRT-PCR分析不同Fn14 siRNA的沉默效果，筛选沉默效率最佳的S3；c，Western Blot分析沉默Fn14表达对LX-2细胞相关蛋白表达影响；d，qRT-PCR分析沉默Fn14表达对LX-2细胞XBP1s、COL1A1、α-SMA基因表达影响；e，Western Blot分析TWEAK蛋白处理对LX-2细胞相关蛋白表达影响；f，qRT-PCR分析TWEAK蛋白处理对LX-2细胞Fn14、XBP1s、α-SMA基因表达影响；g，免疫荧光分析TWEAK蛋白处理对LX-2细胞XBP1s、Fn14表达量影响（×400）。

图  3  Fn14调控IRE1α-XBP1s信号通路

Figure  3.  Fn14 regulates the IRE1α-XBP1s signaling pathway

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2.4   IL-22通过抑制Fn14/ERS信号通路抑制肝星状细胞活化

将细胞分为对照组、TGF-β1组、IL-22+TGF-β1组、IL-22+TGF-β1+TWEAK组，使用对应药物处理LX-2细胞24 h，前三组Western Blot结果与之前实验结果一致，IL-22抑制TGF-β1诱导的Fn14、p-IRE1α、XBP1s、α-SMA和COL1A1蛋白表达。不同的是，在此基础上加入TWEAK上调Fn14后，这种抑制作用反被抵消，Fn14和XBP1s的免疫荧光结果与Western Blot结果相一致（图4）。

注： a，Western Blot分析不同分组处理对LX-2细胞相关蛋白表达影响；b、c为免疫荧光分析同a处理后Fn14、XBP1s表达情况（×400）；d，使用ImageJ软件对a图条带进行了灰度值分析。

图  4  IL-22通过抑制Fn14/ERS信号通路抑制肝星状细胞活化

Figure  4.  IL-22 inhibits HSCs activation by inhibiting Fn14 and negatively regulating the IRE1α-XBP1S signaling pathway

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3.   讨论

对于慢性肝病导致的肝纤维化，目前尚无有效的疗法获得批准^［19］。TGF-β1是机体常见的一种转化生长因子，是正常肝细胞向成纤维样细胞转变的一个重要促进因子^［20］。本研究用TGF-β1诱导肝星状细胞活化，探索IL-22在肝纤维化发展过程中的保护作用。

IL-22是一种新发现的CD4⁺Th细胞因子，具有抑制或促进多种疾病的双重功能^［21］。在血吸虫感染的小鼠肝纤维化模型中，IL-22可激活肝信号转导和转录激活因子3，从而改善肝纤维化^［22］。相反，在慢性病毒性肝炎患者中，IL-22水平显著升高。IL-22在肝病中表现的双重作用可能与疾病病因、疾病阶段及机体免疫状态相关^［23］。在特异性皮炎相关研究^［24］中发现，TWEAK在诱导许多与特异性皮炎发病机制相关的基因方面具有很强的炎症活性，并且该细胞因子具有与两种已识别的特异性皮炎特征细胞因子IL-13或IL-22相当的活性。因此可以推断TWEAK-Fn14信号轴与IL-22之间存在一定的调控关系，本研究发现IL-22不仅能抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化，还首次发现IL-22能抑制TGF-β1诱导后的肝星状细胞Fn14以及ERS相关蛋白XBP1s的表达。

在氧化应激和炎症等应激条件下，内质网可能会不堪重负，导致错误折叠的蛋白质积累以及随之而来的ERS。轻度ERS有助于错误折叠和未折叠蛋白正确折叠，并加强错误折叠蛋白的降解，从而促进细胞存活并维持细胞内环境的平衡。然而，如果应激因素持续存在，ERS将超过未折叠蛋白反应阈值，将诱导细胞凋亡^［25］。在内质网中存在3个传感器，PERK、ATF6和IRE1传感器检测内质网中的蛋白质错误折叠并触发未折叠蛋白反应，是一个维持体内平衡的复杂系统^［26］。在3条信号通路中，IRE1是最保守的，IRE1的N端区域与未折叠的蛋白质结合，而细胞质中的C端区域具有两个激酶和RNase结构域。激活未折叠蛋白反应后，IRE1被自磷酸化，并将XBP1s mRNA与其Rnase结构域剪接，剪接的XBP1通过充当转录因子转移到细胞核来参与调节蛋白质折叠、蛋白质分泌、内质网相关蛋白质降解系统和脂质代谢的基因表达^［27］。在慢性肝病中很容易观察到ERS，许多致病因素如感染、炎症、活性氧、营养剥夺和缺氧等都会激活未折叠蛋白反应信号通路，而未折叠蛋白反应的适应性信号通路IRE1α-XBP1s可保护肝星状细胞免受ERS诱导的凋亡^［28］。研究^［29］表明，IRE1α-XBP1s轴可在TGF-β处理后诱导TANGO1（一种参与胶原I分泌的蛋白质）上调。未折叠蛋白反应激活诱导TANGO1上调，从而促进肝纤维化。这与本研究的实验结论Fn14通过调控IRE1α-XBP1s信号通路促进肝星状细胞活化不谋而合。

Fn14的促纤维化效应已在之前的研究中得到证实^［6-7］。本研究使用TWEAK上调Fn14，首次发现了Fn14的上调能够影响IRE1α-XBP1s通路蛋白的表达。双醋瑞因治疗以剂量依赖的方式对胆管结扎诱导的肝纤维化具有保护作用，并且这种作用可能与调节HMGB1/RAGE/NF-κB/JNK和ERS信号通路有关^［30］。而Fn14是否通过类似于NF-κB胞内信号通路影响IRE1α-XBP1s通路有待进一步研究。

总之，本研究表明，IL-22能有效抑制肝星状细胞的活化，并且这一作用机制可能是通过下调Fn14以及由其介导的ERS通路抑制有关。由此表明，IL-22可能是临床治疗肝纤维化的潜在选择。