人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是血浆中最丰富的蛋白质，可通过分离人血浆产生。由于血液来自各行各业的献血者，此类制剂存在含有病毒或朊病毒污染物的风险，对使用者健康构成潜在威胁。此外，人体血浆的供应也受到多方面因素影响。易于储存、半衰期长且充足、稳定的功能性白蛋白分子供应，一直是未被满足的临床需求。因此，开发大规模生产HSA的替代方法是十分必要的，有利于改善血液和血液制品的短缺问题。重组DNA技术为生物制药的大规模生产提供了新可能，从而无需单一依赖人类血液制品。

通过基因工程技术将HSA基因克隆到微生物、动物、植物宿主上进行高效表达，是一种具有前景的方法。2024年4月，全球首例重组HSA（rHSA）注射液在俄罗斯成功上市，这也是目前唯一上市销售的rHSA注射液产品，填补了世界生物医药产业的空白。这一产品由我国通化安睿特生物制药股份有限公司自主研发，笔者团队牵头完成了Ⅱ、Ⅲ期多中心临床试验。

rHSA在不同表达系统中的研究进展表明，酵母和细菌表达系统是目前比较成熟的生产方式，尤其是酵母表达系统，因其高表达量和相对简单的提取技术而具有工业化潜力。武汉禾元生物科技股份有限公司利用基因工程技术合成HSA，其核心产品HY1001植物源rHSA注射液（OsrHSA）已完成Ⅲ期临床试验。此外，尚有利用异种动物如猪、牛等生产rHSA等。该领域的不断进步将有力提升基因工程技术在HSA生产中的应用潜力以及rHSA在未来生物医药领域的重要性。

1.   HSA的生物学特性及在慢性肝病中的应用

正常情况下，人体总HSA水平为3.5～5.0 g/kgBW，主要通过调节白蛋白的合成、分布和降解来维持。HSA的主要临床用途是维持胶体渗透压和增加循环血浆容量，适用于纠正低血容量、烧伤和导致白蛋白丢失的各种疾病，经典剂量为每剂超过10 g。

1.1   HSA的合成、分布与降解

HSA的合成属于自我调节，发生在肝细胞核糖体中，98%的HSA被释放，其余被保留。生理条件下，机体每日可合成10～15 g HSA。在晚期肝病患者中，肝细胞受损及持续性炎症等导致白蛋白合成能力下降，进而引发低白蛋白血症。

HSA在合成后30 min内进入血液循环，约40%停留在血管床内，其余则移至血管外，血管内外之间的运动被称为经毛细血管逃逸。经毛细血管逃逸率被用于定义HSA的有效水平。白蛋白以每小时5%的速率从血浆渗漏到淋巴循环，以相同的速率（100 mL/h）通过淋巴系统返回。肝硬化伴或不伴腹水患者的门静脉高压和内皮损伤，白蛋白经毛细血管逃逸翻倍，导致液体潴留、双下肢浮肿和腹水等。清蛋白激活蛋白是一种糖蛋白60受体，存在于诸多器官（大脑除外）的血管床中，其与HSA结合，并在不到13 s的时间内将HSA运送到间质侧。输注HSA的分布取决于受者的血容量和蛋白质状态。根据白蛋白经毛细血管逃逸率的不同，扩容仅持续12～24 h。

在健康个体中，HSA的合成和降解处于稳定状态。半衰期为12.7～18.2 d，降解率约为14 g/d。主要降解部位包括肌肉和皮肤（40%～60%）、肝脏（10%～15%）、肾脏（10%）和胃（10%）。在肝硬化患者中，血管内皮受损，导致老化、结构改变或变性的HSA分子堆积，这些分子可长时间停留于循环中，并可能对机体产生不利影响^［1］。

1.2   HSA的结构与功能

成熟HSA具有585个氨基酸（AA）残基的单肽链，分子量为66.438 kD。HSA是非糖基化的，带负电荷，并且具有独特的35个半胱氨酸（Cys） AA残基，其中，34个形成二硫键以保持稳定性和二级结构，在34位留下一个自由残基（Cys34残基），构成了血浆中的主要硫醇库。HSA的晶体结构显示出3个同源结构域，形成一个心形的三级结构。在危重型肝硬化患者中，该结构随机体pH值、温度、化学环境和/或配体相互作用等发生暂时或永久性改变。

HSA的生理功能大致可以分为胶体渗透压功能和非胶体渗透压功能。白蛋白占血液中血浆胶体渗透压（25～33 mmHg）的80%，约2/3的胶体渗透压作用与白蛋白的分子质量有关，其余部分与白蛋白的负电荷有关。负电荷吸引带正电荷的分子（例如Na⁺）进入血管内部，称为Gibbs-Donnan效应^［1］。

HSA运输药物、金属阳离子、气体、难溶于水的分子（胆盐、胆固醇、脂肪酸、胆红素等）、激素（类固醇、甲状腺素）等。由于HSA分子上酸性残基与碱性残基的比例，其表现趋于弱酸性。低白蛋白血症增加阴离子间隙，进而被动增加碳酸氢盐浓度，导致代谢性碱中毒。HSA具有抗血栓特性，主要与亚硝基白蛋白（HSA-N-O）的形成有关，HSA-N-O可通过阻止NO的快速失活来增强血小板的抗聚集特性。HSA还可调节炎症细胞的信号通路和促炎细胞因子的释放，抑制补体因子（C5a）的分泌；其内化和抑制内源Toll样受体信号并调节免疫细胞转录组。HSA在血管内皮稳定和维持毛细血管通透性方面也发挥重要作用。在高胆红素血症和低白蛋白血症中，一个HSA分子与众多胆红素分子结合，阻止其他配体的结合；外源性HSA可增加胆红素结合能力，减少高胆红素水平的不良影响^［2］。

1.3   HSA在慢性肝病中的应用

目前，HSA被认为是机体中重要的抗氧化分子。在以系统性炎症反应和氧化应激增强为特征的疾病（如肝硬化）中，会发生HSA的结构和功能损害，HSA构象改变对疾病进展的影响尚有待探索。“有效白蛋白浓度”的提出拓宽了对HSA在慢性肝病中应用的认知，即不仅仅是为了提高HSA水平。近期研究表明，有效白蛋白浓度可有助于肝硬化患者的分层，提高对预后判断的准确性^［3］。

HSA输注目前用于短期或长期预防或治疗失代偿期肝硬化的各种并发症，也用于改善生活质量。在大量穿刺放液、肝肾综合征/急性肾损伤、自发性细菌性腹膜炎、失代偿期肝硬化伴腹水中，长期HSA治疗获得了肯定的疗效。此外，HSA输注在高容量性低钠血症、自发性细菌性腹膜炎以外的细菌感染和肝性脑病中的应用也获得了较为明确的疗效^［4］。

HSA长期治疗费用昂贵，且不易储存，易被病原体污染。因此，rHSA作为其替代品是未来的发展方向，基因工程技术提供了未来发展的可能性。

2.   基因工程HSA进展

rHSA的大规模生产对重组蛋白生产技术极具挑战性。产品极高纯度、降低rHSA的单位生产成本以及大规模工业化生产等要求，加大了这一领域的研发难度。近40年以来，国际上众多实验室和公司已陆续尝试通过遗传工程开发HSA，其基因已被引入细菌、真菌、植物以及动物中进行表达。

2.1   利用原核表达系统表达rHSA

促进非动物源性rHSA的生产，大肠杆菌是最方便的宿主之一。大肠杆菌具有生长迅速、使用廉价以及短时间达到高细胞密度的特点，与其他表达宿主相比，其发酵过程更经济，衍生的重组产品具有更大的经济潜力。目前，利用大肠杆菌作为宿主获取富含二硫的多结构域蛋白的主要瓶颈是形成过表达蛋白的聚集体。大部分表达的rHSA在大肠杆菌胞浆中形成包涵体（占总表达量的90%以上）。从包涵体中恢复有功能的rHSA不可取，获取像rHSA这样富含多结构域二硫键天然形式的有功能大分子蛋白质十分困难，净化过程繁琐、耗时、费力且费用昂贵。由于上述限制，大肠杆菌宿主系统在过去的几十年中，在rHSA基因工程生产领域未能得到足够的重视。

近期，有研究利用大肠杆菌作为宿主的能力来增强rHSA的功能性生产，通过优化细胞内环境、温度、诱导类型、诱导持续时间、细胞裂解条件等参数，提高所需蛋白在体内的天然形式的生产水平。同时，研究还探索了不同类型的外源伴侣系统对rHSA在大肠杆菌宿主系统中的功能表达的影响。通过上述改进，大肠杆菌宿主系统展现出快速生长、发酵成本低、可扩展的特性，作为微生物工厂，可用于增强rHSA的功能性生产^［5］。

为进一步克服在大肠杆菌中产生功能性rHSA的难题，有研究通过对细胞内蛋白质折叠的生物系统进行工程改造，纯化了大肠杆菌衍生的rHSA。通过监测其构象性质、二级和三级结构元素、表面性质、配体结合性质、稳定性等问题，对其进行详细的物理化学表征，并将上述参数与天然存在的人源蛋白进行比较，结果提示，重组蛋白与天然蛋白完全相同^［6］。

大分子量和较高二硫化物含量阻碍了细菌宿主对rHSA的表达和产生。有研究采用融合技术和工程大肠杆菌菌株的策略来提高可溶性rHSA在细菌细胞质中的表达。在Origami 2中表达的人蛋白二硫异构酶（PDIb'a'）和麦芽糖结合蛋白标记的rHSA b'a'结构域，在18 °C下的溶解度分别显著提高了90.1%和96%。通过建立简单有效的rHSA纯化方案，成功地从500 mL纯度为97%的培养物中获得约9.46 mg rHSA。rHSA主要以可溶性低聚物形式获得，进一步通过引入简单的重折叠和排粒径层析步骤，以34%的回收率获得了单体rHSA。天然聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了大肠杆菌衍生的单体rHSA与商业单体HSA在分子量上的相似性^［7］。

2.2   利用真核表达系统表达rHSA

真核生物中应用最广泛的是酵母表达系统。用低等真核生物酵母表达系统表达外源基因，可将基因工程产物直接分泌到培养基内。培养基内是氧化环境，有利于二硫键形成以及表达出天然构象的蛋白质分子。

利用甲基营养型酵母毕赤酵母已成功生产出rHSA。为提高rHSA在毕赤酵母中的产量，已有研究小组建立了一种优化的补料分批重复发酵方法。通过建立分批补料发酵的仿真模型，采用动态规划法计算5个不同补料周期的最优甲醇补料策略。从计算结果中收集必要的状态变量，用于进一步优化重复补料分批发酵。利用预先收集的状态变量，研究最优操作策略。结果表明，第2次补料分批发酵初始细胞质量为35或40 g，甲醇加料时间为264 h。采用最优操作策略重复补料分批发酵时，实际培养体积与模型方程模拟值吻合较好，但rHSA产量存在一定差异。这项研究确定的重复补料分批发酵的最佳策略（即4次重复补料分批发酵）可使rHSA年产量增加47%。即使在简单（不重复）补料分批发酵中，培养周期的优化也使rHSA年产量增加28%^［8］。

通过流水线技术纯化的rHSA与血浆来源的HSA（pdHSA）相同，未检测到来自毕赤酵母的甘露聚糖成分。rHSA的结构和功能特性与pdHSA相似。临床前和临床试验证实了该rHSA制剂在不同疾病情况下的安全性和有效性，如失血性休克、肝硬化合并腹水以及其他与血浆容量和胶体渗透压相关的危重临床情况^［9］。

近期，有团队通过基因工程技术提高毕赤酵母中重组蛋白的分泌滴度。研究者通过删除不需要的内源性蛋白，细胞资源可以从生产内源性蛋白重新定向分配至生产重组蛋白。通过质谱分析和信号肽预测，发现一组内源性分泌蛋白，而这组蛋白受到必需基因的调控。为了预测必需基因，研究者设计、转化并测序了一个引导RNA文库，用于CRISPR-cas9介导的所有内源性分泌蛋白的敲除；利用预测基因必要性来指导多达11个非必需基因的迭代破坏。工程菌株的HSA产量增加了20倍。结果表明，只要破坏6个基因即可增加重组蛋白的产量，进一步降低毕赤酵母菌的内源蛋白质可进一步提高菌株的性能^［10］。

来自食品级表达系统的蛋白质可用于食品和医疗实践。以乳酸克鲁维酵母GG799为宿主对HSA进行分泌表达。以pPIC9k-HSA为模板，采用带有XhoⅠ和NotⅠ酶切位点的引物聚合酶链式反应（PCR）扩增获得HSA基因，经XhoⅠ和NotⅠ双酶切后插入pKLAC1，构建表达载体pKLAC1-HSA。经SalⅡ线性化后，转化乳酸克鲁维酵母GG799，用含5 mmol/L乙酰胺的YCB平板筛选阳性转化子。提取基因组DNA，采用PCR对转化子鉴定后进行发酵。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western Blot分析发酵上清液中的表达产物，并初步分析酵母基础N源（YNB）对rHSA在乳酸克鲁维酵母GG799中表达的影响。结果表明，rHSA成功在乳酸克鲁维酵母GG799中分泌表达，表达量为81 μg/mL，遗传稳定性好。

将URA3缺失菌株与无耐药选择的质粒载体结合，可作为乳酸克卢维酵母表达载体的一步构建方法。通过与特殊的重组酶反应，以靶向方式组装载体的邻近DNA元件，形成质粒载体。去除不需要的含有pUC来源和氨苄西林耐药基因的片段，分离纯化转化前的载体。PCR、测序和Western Blot分析均表明载体构建和rHSA表达方法是成功的。该方法适用于任何含有URA3基因的物种，该系统有望成为促进食品安全物种中蛋白质表达的安全而有力的工具^［11］。

酿酒酵母是一种广泛应用于蛋白质生产的细胞工厂。提高酵母菌的蛋白质生产能力将有利于获得重组蛋白作为产品或发挥其在强化生物加工中的能力。异源蛋白的表达通常会对细胞施加压力，提高细胞应对压力的能力可以提高蛋白质产量。HAC1是未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）的关键转录因子。有研究者选择与UPR信号通路相关的几个基因，包括未折叠蛋白传感、HAC1 mRNA剪接、mRNA连接、mRNA衰变、翻译和HAC1p降解，作为改造酵母菌的靶点。最终，工程菌株rHSA的产量达到对照菌株的15.3倍。结果表明，对UPR关键节点HAC1相关基因进行细胞工程处理可显著增加蛋白分泌，遗传修饰为构建酵母细胞工厂以高效生产蛋白质提供了有用的靶点^［12］。

白蛋白在肝脏合成后进入体循环，会经历氧化、糖基化、氨基酸缺失及聚合等老化修饰，导致有效成分下降。重组白蛋白在宿主细胞中表达时会发生糖基化，生产过程中也可能产生聚合、氧化等修饰，这些修饰会降低其与配体的结合能力，并可能引发免疫原性。血浆提取的人血清白蛋白约有40%在体内老化，而酵母表达的重组白蛋白结构与天然白蛋白高度相似（>90%），因此在结构和体外药效学上优于人血清白蛋白。

2.3   利用转基因植物表达rHSA

为了确定植物细胞培养是否可以提供替代来源，有研究小组利用豇豆花叶病毒蛋白表达系统（CPMV-HT）在烟草Bright Yellow-2（BY-2）细胞中稳定表达rHSA。rHSA在培养基中稳定生成，产量高达11.88 g/mL，占可溶性蛋白总量的0.7%。在pH值为8.0的改良Murashige和Skoog培养基中培养转基因细胞，rHSA的产量提高了2倍。研究者自行开发简单的纯化方案，从培养基中纯化rHSA，使分泌的rHSA回收率达到48.41%。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析和N端序列分析表明，植物细胞源性rHSA与血浆源性HSA相同。结果表明，CPMV-HT系统可以用于在转基因烟草细胞中高水平表达rHSA^［13］。

禾元生物自主研发的国际领先植物重组蛋白表达与纯化技术平台成功解决了rHSA的纯度、规模化和成本问题。利用水稻胚乳细胞生物反应器高效重组蛋白表达平台OryzHiExp和重组蛋白纯化技术平台OryzPur，高效表达各种医药蛋白，利用较为简单的工艺获得高纯度，高活性，低宿主蛋白和核酸残留的高纯化重组蛋白，且能实现从毫克级到千克级，乃至吨级的不同蛋白质纯化规模化生产。植物源rHSA注射液（OsrHSA，HY1001）是利用水稻胚乳细胞表达，经提取、纯化的rHSA产品并经临床Ⅰ期研究结果证明OsrHSA具有良好的安全性和耐受性。笔者团队牵头完成了该产品的Ⅱ、Ⅲ期临床试验。在Ⅱ期试验中，达到主要临床研究终点；在Ⅲ期临床试验中，疗效不劣于对照HSA，安全性良好。

2.4   利用转基因动物表达rHSA

在诸多情况下，对大型家养动物进行精确的基因组修饰是可行的。有研究利用转录激活因子样效应核酸酶和11.5 kb的HSA小基因供体构建物共同转染纯种牛成纤维细胞，用于同时破坏和取代牛血清白蛋白在肝脏和牛奶中的表达，并控制rHSA的表达。在转染的成纤维细胞中，HSA基因的靶向整合率约为11%，利用体细胞核移植从目标成纤维细胞中获得了转基因牛胚胎。该研究为下一代转基因rHSA牛奠定了基础，有望作为大规模、可靠和质量控制的rHSA来源^［14］。

尚有研究将人白蛋白cDNA敲入猪白蛋白基因座以生产rHSA，结果显示，同源重组可在猪受精卵中高效发生。经过处理的受精卵所生仔猪（n=16）均携带预期的敲入蛋白等位基因，并进一步证实其血液中存在人白蛋白。此外，敲入等位基因成功通过种系传播。综上所述，将猪和其他大型家养动物作为生物反应器的更多研究探索，对推进生物医学产品生产及更理想性状牲畜品种的选育具有重要意义^［15］。

3.   结语

HSA是临床常用药物，目前仍以传统方法从人血浆中分离。国内生产供不应求，尚有部分缺口依赖国外进口。基因工程HSA具有纯度更高、无动物组分、无病毒残留等优势，随着HSA供需矛盾的加剧和质量控制要求的提高，其市场前景十分广阔，同时也需要接受未来更多临床实践的检验。