急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是常见消化系统急腹症之一，进展迅速、预后凶险，常伴有其他器官功能损害，严重者可诱发多器官功能障碍综合征^［1］。在胰腺炎中，早期持续的器官功能衰竭被认为是死亡的主要原因^［2］。AP并发肝损伤是常见的胰外脏器损伤之一，但其损伤机理尚未完全明了并缺乏有效治疗药物^［3］。松果菊苷（echinacoside，ECH）是从肉苁蓉中分离纯化的主要苯乙醇苷之一，具有抗衰老和抗疲劳^［4-6］、抗氧化^［7］、抗炎^［8］、肝脏保护^［9］、抗肿瘤^［10］等作用。然而尚无研究表明ECH在AP肝损伤中的保护作用及其具体机制。本研究通过建立AP大鼠模型，探讨ECH在AP肝损伤中的保护作用，以期为临床面对AP肝损伤问题探索新的预防和治疗方法。

1.   材料与方法

1.1   实验动物

SPF级雄性SD大鼠24只，7周龄，体质量（210±20）g，购自北京华阜康生物科技有限公司，合格证号：110322220100347884，生产许可证编号：SCXK（京）2019-0008，使用许可证编号：SYXK（青）2020-0001。动物饲养于本实验室IVC动物饲养笼具中，3只动物一笼，以保证动物足够的活动空间。动物自由摄食水，昼夜循环各12 h，维持湿度45%～55%，温度维持（22±2）℃。动物于本实验室适应性喂养1周后进行实验。

1.2   主要材料及仪器

ECH（B21209）、雨蛙素（S62702）购于上海源叶生物公司；IL-1β（E-EL-R0012c）、IL-6（E-EL-R0015c）、TNF-α（E-EL-R2856c）、IL-10（E-EL-R0016c）、ELISA试剂盒购自Elabscience公司；BCA蛋白定量试剂盒（23227）、增强型ECL发光液（34096）、RIPA裂解液（89901）购自Thermo Fisher Scientific公司；PVDF膜（03010040001）购自美国MILLIPORE公司。Infinite M 200酶标仪（瑞士TECAN公司），TP1020组织脱水机（德国Leica公司），EG1150H＋C石蜡包埋机（德国Leica公司），RM2235切片机（德国Leica公司），JEM-1400FLASH透射电镜（日本JEOL公司），BX53正置显微镜（日本Olympus公司），Amersham Imager600化学发光仪（美国GE公司）。

1.3   实验动物分组与模型构建

SD大鼠适应性喂养1周后，将24只大鼠随机分为对照组（Con组）、Con+ECH组、AP组、AP+ECH组4组，每组6只，模型构建前12 h禁食不禁水。Con+ECH组和AP+ECH组在AP模型构建前7 d经腹腔注射ECH，Control组和AP组注射等量生理盐水。采用雨蛙素（50 µg/kg）腹腔注射构建胰腺炎模型^［11］，使用雨蛙素诱导一种短暂形式的间质水肿性AP，其特征是胰腺内明显的高淀粉酶血症、胰腺水肿和中性粒细胞浸润，以及胰腺腺泡细胞空泡化和坏死^［12］。ECH注射30 min后，AP组和AP+ECH组经腹腔注射50 μg/kg雨蛙素，每小时注射1次，连续6次；Con组和Con+ECH组经腹腔注射等量生理盐水。雨蛙素末次给药24 h后，留取血液标本和组织标本进行后续实验研究。

1.4   标本采集

雨蛙素末次给药后24 h，使用2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，从腹主动脉采集促凝血分离血清。大鼠颈椎脱臼安乐死后，取部分胰腺和肝脏组织用4%多聚甲醛固定后进行形态学观察。部分胰腺和肝脏组织于-80 ℃保存用于后续分子生物学研究。取部分胰腺组织称量湿重，置于90 ℃烘箱中烘干48 h后称重即为干重。胰腺组织的含水量表达为（湿重－干重）／湿重×100％。

1.5   生物化学检测

采集促凝血于室温放置2 h后，3 600 r/min离心10 min分离血清。使用BS-240 VET全自动动物生化分析仪检测血清中AST、ALT、GGT、LDH、ALP、Alb、TBil、ChE、AMY、LIP水平，通过这些指标明确胰腺炎模型建立情况和肝损伤情况。

1.6   ELISA检测

ELISA试剂盒用于检测肝组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10水平。用万分秤准确称量0.1 g肝组织，加入1 mL生理盐水后电动匀浆器将肝组织制备成匀浆液，4 ℃、5 000 r/min离心10 min后收集上清液用于ELISA检测。使用Infinite M200酶标仪测定450 nm处吸光度值，依据标准曲线计算各个样本浓度。

1.7   HE染色

肝脏和胰腺组织用4%多聚甲醛固定48 h，梯度乙醇梯度脱水，石蜡包埋后制备成5 μm切片。切片常规脱蜡至水，使用苏木素染色液染色15 min。自来水冲10 min，盐酸-乙醇分化6 s，流动水下冲洗20 min，直到出现蓝色为止。置于85%乙醇中3～5 min后，使用伊红染色液染色3～5 min。水洗3～5 s后，脱水、透明后中性树胶封固，于Olympus BX53显微镜下观察并拍照。组织病理学评估由一名病理学家在不知分组情况下进行，根据水肿、炎症、空泡化和坏死情况评估胰腺炎严重程度。肝脏充血肿大，血清ALT、AST等肝损伤指标显著增高，肝出现小叶中心性坏死，肝小叶内可见片状或桥状坏死，炎细胞聚集，以上提示AP肝损伤造模成功^［13］。

1.8   透射电镜观察

肝脏和胰腺组织样品经2.5%戊二醛固定24 h。随后，将样品在1%四氧化锇中固定2 h。样品脱水后用环氧树脂包埋。将标本制备成50 nm切片，柠檬酸铅染色后置于JEM-1400FLASH透射电镜（JEOL）下观察。

1.9   免疫组织化学检测

肝脏和胰腺组织用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后进行切片，使用柠檬酸缓冲液（pH=6.0）对切片进行抗原修复。然后切片上滴加3%过氧化氢室温下孵育20 min以阻断内源性过氧化物酶。随后切片用5%牛血清封闭45 min。将p-p65（1∶300）、TNF-α（1∶300）一抗滴加于切片上，于湿化盒中4 ℃孵育过夜。然后在室温下与二抗孵育45 min。为了进行免疫组化分析，切片与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物孵育，随后用二氨基联苯胺显色。最后，切片用苏木素复染，逐级乙醇脱水，并用中性树胶封片。切片置于Olympus BX53倒置显微镜下观察并拍照，结果以面积密度（阳性细胞面积/整个场面积）表示。

1.10   Western Blot检测

组织中加入适量含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液，使用电动匀浆器匀浆后于冰上裂解30 min。以12 000 r/min在4 ℃下离心10 min，保留上清液并使用BCA法测定蛋白样品浓度。取20～40 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将电泳分离的蛋白质转移到0.2 μm PVDF膜上。将膜用5%脱脂奶粉或3% BSA室温封闭1 h后，将膜于髓样分化因子88（MyD88）（1∶1 000）、IκBα（1∶1 000）、p-IκBα（1∶1 000）、p-NFκB p65（1∶1 000）、NFκB p65（1∶1 000）、p-IKKα（1∶1 000）、IKKα（1∶1 000）、β-actin（1∶1 500）或GAPDH（1∶1 000）一抗于4 ℃孵育过夜。将膜用1×Tris-buffered saline-Tween 20（TBST）洗涤后，与HRP标记的山羊抗兔二抗在室温下孵育1 h。1×TBST洗涤后，用超敏ECL发光溶液加入到PVDF膜上使用GE Amersham Imager600仪器进行显影。使用Image-J软件分析免疫反应蛋白条带。每种蛋白质的相对表达水平用靶蛋白条带灰度与内参蛋白灰度的比值表示。对于磷酸化蛋白，相对表达水平以磷酸化靶蛋白灰度与总靶蛋白灰度之比表示。

1.11   统计学方法

以GraphPad 8.0进行图形绘制和统计学分析。计量资料以x¯±s表示。多组间变量比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q或Dunnett’s T3分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   ECH治疗后胰腺生化指标的影响

AP组大鼠血清中血清淀粉酶（AMY）和脂肪酶（LPS）相比于Con组升高（P值均<0.01）。与AP组比较，AP+ECH组小鼠血清AMY、LPS水平均下降（P值均<0.01）（图1）。这表明ECH治疗能部分降低由雨蛙素引起的血清AMY和LPS升高。

图  1  ECH对AP大鼠模型血清AMY和LPS活性的影响

Figure  1.  The effects of Echinacoside on serum amylase and lipase activity in rats with Cerulein-induced acute pancreatitis

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2.2   ECH对肝酶指标的影响

AP组大鼠血清中ALT、AST、GGT、LDH、ALP、TBil相比于Con组均升高，AP组大鼠血清中Alb、ChE相比于Con组下降（P值均<0.01）。与AP组比较，AP+ECH组大鼠血清中ALT、AST、GGT、ALP、TBil水平均下降，AP+ECH组大鼠血清中Alb、ChE升高，差异均有统计学意义（P值均<0.01）（表1）。这一方面表明雨蛙素注射后能引起AP肝损伤，另一方面表明ECH治疗能部分降低由胰腺炎引起的血清ALT、AST、GGT、ALP、TBil升高。

表  1  ECH对雨蛙素诱导AP大鼠肝酶水平的影响

Table  1.  The effects of Echinacoside on hepatic enzyme in rats with Cerulein-induced acute pancreatitis

项目	Con组（n=6）	Con+ECH组（n=6）	AP组（n=6）	AP+ECH组（n=6）	F值	P值
ALT（U/L）	37.35±11.04	32.95±9.90	185.07±33.581）	101.05±21.883）	66.53	<0.01
AST（U/L）	138.67±45.21	155.72±52.61	588.58±91.761）	329.28±85.663）	50.93	<0.01
GGT（U/L）	27.13±5.98	27.92±5.35	74.78±22.351）	43.80±11.653）	17.03	<0.01
Alb（U/L）	38.05±2.66	38.72±1.80	15.40±3.821）	27.82±3.343）	79.53	<0.01
ChE（U/L）	114.60±19.36	117.87±21.63	58.35±12.251）	93.95±8.193）	16.96	<0.01
LDH（U/L）	389.72±125.35	381.48±120.51	642.20±155.95	440.87±120.55	5.17	<0.01
ALP（U/L）	26.43±4.56	26.70±5.22	55.88±14.371）	35.77±7.333）	14.88	<0.01
TBil（μmol/L）	5.02±1.00	5.46±1.17	11.56±2.731）	6.25±1.723）	17.34	<0.01
注：与Con组比较，1）P<0.01，2）P<0.05；与AP组比较，3）P<0.01。

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2.3   ECH治疗后胰腺干湿重比较

胰腺湿重比可反映胰腺组织水肿程度。与Con组相比，AP组胰腺干湿重比值增加（P<0.01）；与AP组相比，AP+ECH组干湿重比值下降（P<0.01）（图2）。这些结果表明ECH能部分减轻雨蛙素所引起的胰腺水肿。

图  2  胰腺干湿重比

Figure  2.  The ratio of dry to wet weight of the pancreas

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2.4   胰腺组织病理学检测

胰腺组织HE染色后观察：Con组和Con+ECH组胰腺组织中未见明显病理学改变；AP组胰腺腺泡细胞空泡变性，部分腺泡上皮细胞点状坏死，坏死细胞结构模糊，胞核固缩崩解；AP+ECH组少量腺泡细胞空泡变性，可见少量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主（图3）。AP+ECH组损伤程度较AP组减轻。

注： a，Con组；b，AP组；c，ECH组；d，AP+ECH组

图  3  ECH对AP大鼠胰腺组织病理学改变的影响（HE染色，×400）

Figure  3.  The effect of Echinacoside on the pancreatic morphology of rats with AP（HE staining，×400）

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2.5   肝脏组织病理学检测

肝脏组织HE染色后观察：Con组和Con+ECH组肝组织中无明显病理学改变。AP组部分肝细胞变性坏死，胞核固缩，胞质溶解，坏死区域及周围肝窦内炎性细胞浸润增加。与AP组相比，AP+ECH组肝细胞形态相对正常，仅见少量变性坏死，肝窦结构正常，少量炎性细胞浸润（图4）。

注： a，Con组；b，AP组；c，ECH组；d，AP+ECH组

图  4  ECH对AP大鼠肝脏组织病理学改变的影响（HE染色，×400）

Figure  4.  The effect of Echinacoside on the hepatic morphology of rats with AP （HE staining，×400）

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2.6   肝脏和胰腺透射电镜观察

肝脏组织透射电镜观察：Con组和Con+ECH组肝细胞内细胞器结构正常；AP组肝细胞内数线粒体出现肿胀，线粒体膜破裂，胞浆中有较多自噬体存在；AP+ECH组结构较为正常，细胞器结构均较完整，胞浆中有少量自噬体存在（图5）。

注： a，Con组（×25 000）；b，AP组（×8 000）；c，ECH组（×25 000）；d，AP+ECH组（×8 000）。N：细胞核；Mi：线粒体；APG：自噬体。

图  5  TEM观察肝组织微观结构变化

Figure  5.  Changes of hepatic microscopic structure under TEM

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胰腺组织透射电镜观察：Con组和ECH组胰腺腺泡细胞形态结构较正常，细胞核呈圆形，染色质分布均匀，胞浆中各细胞器结构完整清晰；AP组腺泡细胞细胞核呈不规则形，大多数线粒体出现肿胀，线粒体嵴断裂，粗面内质网扩张，胞浆中有较多自噬体；AP+ECH组腺泡细胞形态结构存在轻度异常，细胞核呈不规则形，少数线粒体出现轻度肿胀，部分粗面内质网轻微扩张，胞浆中有少量自噬体存在（图6）。

注： a，Con组（×25 000）；b，AP组（×8 000）；c，ECH组（×25 000）；d，AP+ECH组（×8 000）。ZG：酶原颗粒；ER：内质网。

图  6  TEM观察胰腺组织微观结构变化

Figure  6.  Changes of pancreatic microscopic structure under TEM

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2.7   ELISA监测大鼠肝组织匀浆IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10水平

与Con组比较，AP组大鼠肝脏组织匀浆IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10水平均增高（P值均<0.01）；与AP组比较，AP+ECH组大鼠肝脏组织匀浆IL-1β、IL-6、TNF-α水平均下降（P值均<0.05）（图7）。

图  7  大鼠IL1β、IL-6、TNF-α、IL-10炎症因子变化水平

Figure  7.  Change levels of inflammatory factors of IL-1β， IL-6， TNF-α and IL-10 in rats

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2.8   免疫组化检测胰腺和肝组织中p-p65 NFκB、TNF-α表达

与Con组大鼠相比，AP组胰腺和肝脏组织中p-NFκB p65、TNF-α的表达增加（P值均<0.05）（图8）。在使用ECH干预后，与AP组相比，AP+ECH组胰腺和肝脏组织中p-NFκB p65、TNF-α的表达减少（P值均<0.05）（图8）。这些结果表明，ECH可能通过抑制NF-κB p65、TNF-α表达减轻AP肝损伤。

图  8  免疫组化分析胰腺和肝组织中NF-κB p65、TNF-α表达水平

Figure  8.  The expression levels of NF-κB p65 and TNF-α in pancreatic and hepatic tissues with Immunohistochemical analysis

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2.9   Western Blot检测肝组织中MyD88、p-IκBα、p-IKKα、p-p65蛋白表达水平

Western Blot结果表明，与Con组相比，AP组大鼠肝组织中p-IκBα、p-IKKα、p-p65 NFκB、MyD88蛋白表达水平均增加（P值均<0.05）；与AP组相比，AP+ECH组大鼠肝组织中p-IκBα、p-IKKα、p-p65 NFκB、MyD88蛋白表达水平均降低（P值均<0.05）（图9）。这些结果表明，ECH能抑制NFκB信号通路减轻AP肝损伤。

图  9  Western Blot分析肝组织中NF-κB信号通路蛋白表达水平

Figure  9.  The expression levels of NF-κB p65 signaling pathway protein in hepatic tissues with Western blot

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3.   讨论

AP是临床常见消化系统急腹症，具有病情进展快，并发症多等特点，发病时胰腺组织水肿，腺泡细胞死亡，导致血清AMY和LPS升高^［14］。因此，AMY和LPS一直被用作AP的生物标志物^［15］，在胰腺炎的诊断中有重要意义。AP发生时诱导促炎细胞因子的表达和趋化，产生“炎症瀑布级联反应”，损害其他脏器功能，肝脏因与胰腺毗邻，AP时产生的炎症因子可通过门静脉血流或局部扩散进入肝脏损伤肝细胞，因而在AP发生时肝损伤成为重要的并发症^［16-17］。本实验显示，雨蛙素构建AP模型后，AP组血清AST、ALT、GGT、ALP、TBil、AMY、LPS均明显升高，HE染色镜下见胰腺腺泡细胞空泡变性，部分腺泡上皮细胞点状坏死，坏死细胞结构模糊、胞核固缩崩解，肝细胞变性坏死、胞核固缩、胞质溶解、炎性细胞浸润增加。透射电镜检查镜下见肝和胰腺细胞内线粒体出现肿胀，线粒体膜破裂，胞浆中有较多自噬体和次级溶酶体存在，以上改变符合AP肝损伤酶学指标和组织病理学特征。ECH是从中药肉苁茸中提取的苯乙醇苷类化合物之一，具有多种生物学特性。本研究显示，ECH干预组大鼠ALT、AST、GGT、ALP、TBil、AMY、LPS水平较AP均明显下降，肝脏、胰腺HE染色见组织损伤减轻，TEM肝和胰腺细胞器损伤不同程度修复，以上结果提示ECH干预可有效降低AP肝损伤大鼠胰酶、肝酶，缓解胰腺和肝脏组织病理损伤。既往研究显示：ECH可以减轻氧化应激和肝脂肪变性，从而保护乙醇诱导的肝损伤^［18］；ECH也改善脓毒症大鼠的肝损伤和炎症反应^［19］。本研究与上述结果一致。

本实验结果显示，AP组大鼠肝组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显升高，ECH药物干预后上述炎症因子水平降低，提示ECH抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌。王欢等^［20］研究显示，化纤柔肝饮辅助西药治疗乙型肝炎肝纤维化可保护肝功能，其作用可能与其对血清IL-6、TNF-α及TGF-β1水平调控有关。冯韦韦等^［21］的研究显示，芹菜素对缺血-再灌注损伤大鼠模型肝损伤的保护机制之一为下调血IL-1β、IL-6、TNF-α表达；刘江凯等^［22］的研究显示，退黄合剂能够抑制急性肝衰竭大鼠模型细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达而保护受损的肝细胞。

Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）是先天免疫系统中一类重要的模式识别受体^［23-24］，TLR4是分布于炎症细胞表面、识别病原分子的TLR超家族成员之一。MyD88是所有TLR（TLR3除外）的常见衔接蛋白^［25］。TLR4及其独特的配体可以激活MyD88和NF-κB，进而诱导TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性细胞因子的表达^［26-29］。TLR4在脂多糖等刺激下激活下游MyD88诱导炎症发生^［30-31］，而MyD88的缺失通过减少肝损伤、炎症、纤维化和癌变在肝损伤过程中具有保护作用^［32］，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路可以减轻肝脏炎症的发生^［33-34］。党琳等^［35］研究显示柴芩承气汤可能通过抑制肝组织TLR4/NF-κB p65通路活化，降低促炎因子水平，从而减轻小鼠SAP并发肝损伤；陆贝等^［36］研究发现PPAR-γ激动剂可能通过抑制NF-κB/TLR4信号传导通路的活性，下调下游促炎细胞因子水平，从而减轻AP过程中的肝细胞损伤。本研究结果显示AP组肝脏和胰腺组织中p-p65 NFκB、TNF-α表达增加，肝脏组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路关键效应分子MyD88、p-IκBα、p-IKKα、p-p65表达均增加，ECH干预后上述分子表达逆转，提示ECH通过调控TLR4/MyD88/NF-κB效应分子进而抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等异常分泌，发挥保护胰腺和肝功能的作用。已有研究显示，ECH通过调节应激活化p38MAPK和NF-κB p52信号对小鼠帕金森模型发挥神经保护作用^［37］，也可通过阻断HBX/TREM2介导的NF-κB信号通路促进人肾小管上皮细胞增殖^［38］。总体而言，这些发现表明ECH可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥保护胰腺和肝脏的作用。

综上所述，AP大鼠肝脏组织/MyD88/NF-κB信号通路的关键效应分子MyD88、p-IκBα、p-IKKα、p-p65表达增高，可能是调控AP肝细胞异常凋亡的潜在分子机制之一。ECH可通过下调急性胰腺炎大鼠肝组织TLR4、MyD88、p-IκBα、p-IKKα、p-p65的表达，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通道活化进而抑制肝细胞凋亡，减轻胰腺和肝损伤程度及炎细胞浸润，改善AP肝损伤预后，可为ECH的临床应用提供可靠的实验依据。