非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是世界范围内最常见的慢性肝病，在全球普通人群中的患病率高达38%^［1-2］。因此，早期预防和阻断NAFLD意义重大。

脂肪在肝脏中不断沉积导致脂质代谢紊乱与脂肪酸氧化应激产生的炎症因子共同构成NAFLD肝细胞损伤的主要病理环节^［3］。肝脂质代谢紊乱可导致线粒体功能障碍，进而引起肝损伤。肝脏线粒体自噬在清除肝细胞受损线粒体，肝脏保护方面起着重要作用^［4］。随着中医药研究的不断深入，中药复方在减轻肝炎症状、改善肝功能、肝脂肪变性以及延缓肝纤维化等方面疗效显著^［5］。已成为当前研究热点。本课题组前期研究^［6］表明，芪术方可减轻高脂高胆固醇饮食诱导的NASH小鼠肝损伤。为进一步探索其作用机制，本研究通过建立高脂高胆固醇高果糖饮食NAFLD小鼠模型，为芪术方的临床运用提供更多实验基础。

1.   材料与方法

1.1   实验动物与饲料

60只SPF级雄性C57BL/6J小鼠，6～8周龄，体质量20～25 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证编号：SCXK（沪）2022-0004。实验动物使用许可证编号：SCXK（沪）2020-0009。小鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心。温度20～24 ℃、湿度45%～55%、12 h光暗周期。高脂高胆固醇饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，许可证号：苏饲证（2019）01008。果糖由南通特洛菲饲料科技有限公司提供。

1.2   药物组成与制备

芪术方：生黄芪15 g（上海虹桥中药饮片有限公司，220919）、虎杖9 g（上海康桥中药饮片有限公司，221105）、杠板归9 g、泽兰9 g、苍术9 g（上海万仕诚药业有限公司，20221006-1、20220923-1、20220821-1）、广陈皮6 g（上海养和堂中药饮片有限公司，2022092407）。

提取工艺：将所有饮片加入药品体积12倍纯水中浸泡1 h，煮沸后提取滤液，共提取3次，加热浓缩至含生药0.475、0.95、1.90 g/mL的浓缩液。将多唏磷脂酰胆碱（北京赛诺菲制药有限公司，H20059010，CBJD471）溶于纯水中，质量浓度为22.8 g/L，药液于4 ℃冰箱存放备用。多唏磷脂酰胆碱及中药饮片均购自上海中医药大学附属曙光医院，由王卫东主管药师鉴定，符合2020年版《中华人民共和国药典》标准。

1.3   试剂

ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、Freezol Reagent RNA逆转录试剂盒、提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，Q711-03、R223-01、R711-02）；PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；TNF-α、IL-1β、游离脂肪酸（FFA）（上海圆创生物科技有限公司，202308-M028、202308-M009、YCM4328）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）（ELISA）试剂盒（上海威奥生物科技有限公司，ET0012M、ET0001M）；山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（H+L）抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、组织线粒体分离试剂盒、PMSF（上海碧云天生物技术有限公司，A0208、P0009-1、C3606、ST506）；LC3B抗体、p62/SQSTM1抗体、Beclin-1抗体（杭州华安生物技术有限公司，ET1701-65、HA721171、HA721216）、动力相关蛋白1（Drp1）、GAPDH、β-actin（武汉三鹰技术有限公司，12957-1-AP、60004-1-Ig、23660-1-AP）

1.4   仪器

QuantStudio 6 Pro型聚合酶链式反应（PCR）扩增仪、TSX600型-80 ℃超低温冰箱（美国Thermo Scientific公司）；AMG-2201-023型全自动酶标仪（美国BioTek公司）；1658034型电泳转膜仪ChemiDocMP型凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；Centrifuge 5430R型台式高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.5   方法

1.5.1   造模、分组及给药

60只C57BL/6J雄性小鼠于动物房适应性喂养1周后，随机分为正常组（n=10）、模型组（n=10）和给药组（n=40）。正常组小鼠予正常饲料和饮水，模型组和给药组给予高脂高胆固醇饲料和20%果糖水^［6-7］。造模16周后开始给药，给药组分为芪术方低、中、高剂量组、多唏磷脂酰胆碱组（磷脂组）。根据《中药药理实验方法学》中人与小鼠药物换算方式和本课题组前期研究^［6］，得出芪术方低、中、高剂量组给药剂量为4.75、9.50、19.00 g/kg，成人体质量（按60 kg计算）日服剂量的5、10、20倍，磷脂组给药剂量为228 mg/kg（成人日服剂量的10倍）。第17周起，正常组和模型组每日给予纯水灌胃，其余各组给予对应药物灌胃，每日1次，持续8周。末次给药后，腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉小鼠，眼眶后静脉丛取血收集血清和肝组织样本。

1.5.2   肝组织线粒体提取

称取新鲜肝脏100 mg，按说明书加入试剂匀浆。3 000 r/min，4 ℃，10 min离心后，将上清转移至另一离心管中。12 000 r/min，4 ℃，10 min，沉淀即为线粒体。存放于-80 ℃冰箱备用。

1.5.3   生化指标检测

血清委托上海中医药大学附属曙光医院检验科检测肝功能及血脂。

1.5.4   HE染色

固定好的肝组织石蜡包埋，切片，放入二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水；苏木素、伊红染色5 min，冲水后无水乙醇浸泡脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察各组小鼠肝组织。

1.5.5   油红O染色

冰冻切片复温干燥后固定液浸泡15 min，纯水洗后晾干；油红染液浸染10 min后60%异丙醇分化，自来水冲洗；苏木素染色，纯水浸洗，甘油明胶封片剂封片；镜下观察各组小鼠肝脂质沉积。

1.5.6   透射电镜观察肝组织超微结构

将新鲜肝组织切至1 mm³，放入2.5%戊二醛中固定2 h，清洗3次后放入1%饿酸中固定，清洗3次后，梯度乙醇脱水，丙酮浸透后包埋，半薄定位切片后采用醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染法染色，镜下观察肝组织超微结构。

1.5.7   ELISA法检测炎症因子、脂质代谢、氧化应激相关分子水平

将存放于-80 ℃冰箱的血清取出，依据试剂盒说明书进行操作，检测小鼠血清中TNF-α、IL-1β、FFA、MDA含量和SOD酶活力。

1.5.8   实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测Drp1、p62/SQSTM1、Beclin-1 mRNA表达

按照RNA提取试剂盒说明书提取肝组织RNA，用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR 试剂盒进行逆转录合成cDNA。将cDNA与ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix混合后进行Real-time PCR扩增（反应条件参考说明书），以GAPDH为内参，采用相对定量2^-ΔΔCt法进行分析。PCR引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计提供。序列见表1。

表  1  PCR引物序列

Table  1.  PCR Primer sequence

基因		引物序列
Drp1	上游	5'-AACAGGCAACTGGAGAGGAA-3'
	下游	5'-GCAACTGGAACTGGCACATT-3'
Beclin-1	上游	5-CCAATGTCTTCAATGCCACCTTC-3'
	下游	5'-AGGCAGCATTGATTTCATTCCAC-3'
p62/SQSTM1	上游	5'-CCTTGCCCTACAGCTGAGTC-3'
	下游	5'-CATGTTCCACATCAATGTCAACC-3'
GAPDH	上游	5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'
	下游	5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'

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1.5.9   Western Blot检测肝组织线粒体p62/SQSTM1、Drp1、Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达

使用BCA法检测线粒体蛋白浓度，配置蛋白样品。上样，电泳，转膜，封闭。分别加入一抗p62/SQSTM1、Drp1、Beclin-1、LC3B （1∶1 000），4 ℃孵育过夜后TBST洗膜3次分别加入二抗GAPDH、β-actin（1∶5 000），室温孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL法显影，凝胶成像系统拍摄。以β-Actin和GAPDH为内参，采用Image J进行蛋白质表达定量。

1.6   统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计量资料以x¯±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   芪术方对各组小鼠肝功能、血脂的影响

与正常组相比，模型组小鼠AST、ALT、TC、TG、LDL水平均升高（P值均<0.05）。与模型组相比，各给药组小鼠ALT、AST、TC、TG、LDL水平均降低（P值均<0.05）（表2）。

表  2  各组小鼠肝功能及血脂水平

Table  2.  Effects on liver function and blood glucose of mice in each group

组别	动物数（只）	AST（U/L）	ALT（U/L）	TC（mmol/L）	TG（mmol/L）	LDL（mmol/L）
正常组	6	81.00±31.77	29.33±5.61	2.45±0.11	0.74±0.20	0.44±0.04
模型组	6	179.30±57.571）	142.70±72.791）	6.28±0.651）	0.99±0.251）	1.43±0.281）
芪术方低剂量组	6	117.00±33.002）	70.33±30.532）	4.18±0.222）	0.67±0.092）	0.92±0.232）
芪术方中剂量组	6	90.33±17.082）	31.33±4.842）	3.83±0.682）	0.56±0.092）	0.60±0.122）
芪术方高剂量组	6	81.67±10.842）	26.33±4.082）	3.76±0.202）	0.58±0.062）	0.63±0.072）
磷脂组	6	91.00±21.462）	26.67±4.132）	4.18±0.402）	0.59±0.052）	0.73±0.072）
F值		8.232	12.26	48.40	7.41	28.69
P值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
注：与正常组比较，1）P<0.05；与模型组比较，2）P<0.05。

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2.2   芪术方对各组小鼠肝组织学变化的影响

HE染色结果显示：正常组小鼠肝小叶结构正常，肝细胞边界清晰，无脂肪空泡；模型组小鼠充斥大量脂肪变，伴炎症细胞浸润，肝细胞气球样变；与模型组比较，各用药组均有不同程度改善，其中芪术方中、高剂量组脂肪变显著减轻（图1）。油红O染色结果显示：正常组小鼠肝细胞无红色脂滴；模型组小鼠干细胞内充斥大量形状不规则红色脂滴紧密排列，阳性面积较正常组明显增加（P<0.05）；芪术方各剂量组干预后，较模型组显著改善，其中芪术方中、高剂量组效果显著（P值均<0.01）（图2，表3）。

注： a，正常组；b，模型组；c，芪术方低剂量组；d，芪术方中剂量组；e，芪术方高剂量组；f，磷脂组。

图  1  各组小鼠肝组织HE染色（×200）

Figure  1.  HE staining of liver tissues of mice in each group （×200）

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注： a，正常组；b，模型组；c，芪术方低剂量组；d，芪术方中剂量组；e，芪术方高剂量组；f，磷脂组。

图  2  各组小鼠肝组织油红O染色（×200）

Figure  2.  Oil red O staining of liver tissue of mice in each group （×200）

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表  3  各组小鼠油红O染色面积百分比

Table  3.  Percentage of oil red stained area in each group of mice

组别	动物数（只）	油红O染色阳性面积（%）
正常组	3	0.76±0.42
模型组	3	40.40±7.731）
芪术方低剂量组	3	25.80±3.472）
芪术方中剂量组	3	11.55±2.473）
芪术方高剂量组	3	7.81±1.783）
磷脂组	3	10.93±3.983）
F值		38.43
P值		<0.001
注：与正常组比较，1）P<0.05；与模型组比较，2）P<0.05，3）P<0.01。

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2.3   芪术方对各组小鼠肝脏超微结构的影响

正常组小鼠肝细胞形态正常，细胞内可见大量线粒体、内质网和少量微小脂滴。模型组可见受损肝细胞，大量脂滴，肿胀线粒体及自噬溶酶体。芪术方中、高剂量组与磷脂组细胞胞浆中脂质空泡减少，其中芪术方中、高剂量组中可见自噬小体（图3）。

注： a，正常组；b，模型组；c，芪术方中剂量组；d，芪术方高剂量组；e，磷脂组。黄色箭头代表脂滴，绿色箭头代表自噬溶酶体，红色箭头代表自噬小体。

图  3  各组小鼠肝组织超微结构（×6 000）

Figure  3.  Ultrastructure of liver tissue of mice in each group （×6 000）

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2.4   芪术方对各组小鼠肝脏TNF-α、IL-1β、FFA、MDA及SOD的影响

ELISA结果显示，与正常组相比，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、FFA、MDA表达水平提高，SOD表达水平降低（P值均<0.05）；用药组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、MDA均有不同程度改善（P值均<0.05），IL-1β、FFA、MDA在芪术方中、高剂量组改善作用更为明显（P值均<0.05），芪术方低、中、高剂量组的SOD酶活性较模型组显著提高（P值均<0.05）（表4）。

表  4  各组小鼠TNF-α、IL-1β、FFA、MDA及SOD表达水平

Table  4.  Expression levels of TNF-α， IL-1β， FFA， MDA and SOD in each group of mice

组别	动物数（只）	TNF-α（pg/mL）	IL-1β（pg/mL）	FFA（μmol/L）	MDA（nmol/mL）	SOD（U/L）
正常组	6	575.80±75.86	106.90±10.45	688.50±58.02	1.79±0.18	213.30±50.51
模型组	6	1 976.00±141.201）	206.90±18.001）	1 122.00±102.601）	3.00±0.281）	92.62±6.331）
芪术方低剂量组	6	1 554.00±109.002）	177.50±21.232）	990.80±99.88	2.10±0.102）	201.80±17.612）
芪术方中剂量组	6	1 259.00±144.002）	166.40±16.553）	961.90±95.942）	2.01±0.103）	284.90±54.903）
芪术方高剂量组	6	1 000.00±98.932）	138.50±9.643）	888.30±88.713）	1.97±0.173）	396.10±27.593）
磷脂组	6	805.50±120.602）	127.80±16.253）	771.10±104.103）	2.07±0.063）	476.00±58.713）
F值		114.70	31.62	17.04	39.73	69.36
P值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
注：与正常组比较，1）P<0.05；与模型组比较，2）P<0.05，3）P<0.01。

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2.5   芪术方对各组小鼠肝组织Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1 mRNA的影响

与正常组相较，模型组小鼠肝组织Drp1、Beclin-1 mRNA表达水平增加，p62/SQSTM1 mRNA表达水平降低（P值均<0.05）；与模型组相比，各用药组Drp1、Beclin-1 mRNA表达水平减少，芪术方中、高剂量组p62/SQSTM1 mRNA表达水平增加（P值均<0.05）（表5）。

表  5  各组小鼠Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1 mRNA表达水平

Table  5.  mRNA expression levels of Drp1， Beclin-1， and p62/SQSTM1 in each group of mice

组别	动物数（只）	Drp1	Beclin-1	p62/SQSTM1
正常组	6	1.00±0.19	1.00±0.19	1.00±0.14
模型组	6	2.07±0.391）	2.54±0.631）	0.26±0.111）
芪术方低剂量组	6	1.43±0.222）	1.67±0.262）	0.84±0.17
芪术方中剂量组	6	1.16±0.222）	1.31±0.122）	1.11±0.952）
芪术方高剂量组	6	1.05±0.272）	1.02±0.242）	1.22±0.502）
磷脂组	6	1.14±0.282）	0.97±0.402）	0.61±0.17
F值		13.41	18.55	3.70
P值		<0.001	<0.001	0.010
注：与正常组比较，1）P<0.05；与模型组比较，2）P<0.05。

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2.6   芪术方对各组小鼠肝组织线粒体Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1、LC3B蛋白表达影响

与正常组相比，模型组小鼠肝组织线粒体LC3BⅡ/Ⅰ比值、Drp1、Beclin-1蛋白表达水平明显增加，p62/SQSTM1蛋白表达水平减少（P值均<0.05）；与模型组相比，各用药组LC3B Ⅱ/Ⅰ比值、Drp1、Beclin-1蛋白表达水平降低，部分用药组p62/SQSTM1蛋白表达水平上升（P值均<0.05），其中芪术方中、高剂量组作用更明显（P值均<0.01）（图4，表6）。

注： A，正常组；B，模型组；C，芪术方低剂量组；D，芪术方中剂量组；E，芪术方高剂量组；F，磷脂组。

图  4  芪术方对各组小鼠Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达的影响

Figure  4.  Effect of Qizhu formula on the expression of Drp1， Beclin-1， p62/SQSTM1 and LC3B Ⅱ/Ⅰ in each group of mice

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表  6  各组小鼠Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1、LC3B Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平

Table  6.  Protein expression levels of Drp1， Beclin-1， p62/SQSTM1 and LC3B Ⅱ/Ⅰ in each group of mice

组别	动物数（只）	Drp1	Beclin-1	p62/SQSTM1	LC3B Ⅱ/LC3 ‍Ⅰ
正常组	6	0.64±0.03	0.68±0.01	1.04±0.09	1.35±0.34
模型组	6	1.27±0.061）	1.28±0.031）	0.24±0.011）	3.61±1.731）
芪术方低剂量组	6	0.93±0.172）	1.08±0.043）	0.55±0.05	1.35±0.413）
芪术方中剂量组	6	0.74±0.083）	0.82±0.113）	0.86±0.063）	1.24±0.303）
芪术方高剂量组	6	0.66±0.213）	0.68±0.023）	0.93±0.063）	1.21±0.423）
磷脂组	6	0.49±0.143）	0.93±0.073）	1.12±0.023）	1.23±0.473）
F值		14.08	50.99	116.50	4.36
P值		<0.001	<0.001	<0.001	0.017
注：与正常组比较，1）P<0.05；与模型组比较，2）P<0.05，3）P<0.01。

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3.   讨论

NAFLD患病率逐年上升，中医药治疗NAFLD具有独特优势，芪术方是由上海中医药大学附属曙光医院肝病科研发治疗NAFLD的有效验方，临床疗效好，为进一步探索其作用机制，本实验通过建立高脂高胆固醇高果糖NAFLD小鼠模型，采用不同剂量芪术方干预8周，结果表明，芪术方可显著降低NAFLD小鼠血脂、血清FFA，改善肝功能，减轻肝脏病理损伤及炎症反应。

NAFLD发病机制复杂，目前尚未完全阐明。随着研究的深入，多重打击学说被广泛认可，其中炎症、肝脂肪变性、线粒体功能障碍和脂质过氧化诱发氧化应激在NAFLD发病中起重要作用^［8］。炎症作为NAFLD的关键加速因子，能促进肝脂肪变性向肝纤维化进展^［9］。本研究结果显示，芪术方能减少NAFLD小鼠血清TNF-α、IL-1β、MDA，促进SOD表达，表明芪术方能减轻NAFLD肝脏炎症。芪术方由生黄芪、虎杖、杠板归、泽兰、苍术、广陈皮组成。黄芪中主要活性成分黄芪甲苷对自噬可表现出不同的调控作用。在大鼠心肌再灌注损伤模型中，黄芪甲苷通过降低PINK1/Parkin信号通路表达，抑制线粒体自噬水平，发挥心肌细胞保护作用^［10］。Su等^［11］研究发现，黄芪甲苷上调PINK1线粒体自噬水平，改善糖尿病大鼠线粒体功能障碍。虎杖中的活性成分能够改善胰岛素抵抗、抗氧化应激、调节脂质代谢、改善内质网应激、减轻炎症浸润缓解NAFLD^［12］。虎杖苷可下调ATF6表达抑制自噬改善NAFLD^［13］。苍术苷可促进AMPK活化，降低mTOR活性，诱导自噬体形成，从而加速肝脏中脂质降解^［14］。陈皮中的主要成分川陈皮素除了具有抑制炎症反应、抗肿瘤、改善代谢紊乱等药理作用，也能促进自噬。线粒体自噬是一种发生在线粒体中的高度保守的自我消化过程^［15］，介导受损线粒体的清除，是维持线粒体稳态的重要环节。线粒体自噬功能失调与多种肝脏疾病的发生发展密切相关^［16］，是细胞为应对氧化应激、营养缺乏、衰老等外界刺激的重要防御机制^［17］。Drp1作为线粒体分裂的关键调控因子，能够激活线粒体自噬。Li等^［18］研究表明，柴胡疏肝散可抑制Drp1介导的线粒体过度自噬增强消化不良大鼠胃动力。Drp1与LC3相互作用促进线粒体自噬。LC3作为线粒体自噬标志物，在线粒体自噬过程中发生泛素化，与自噬体的磷脂乙醇胺结合，在自噬体膜上形成LC3Ⅱ。LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平在一定程度上反映了线粒体自噬水平^［19］。p62/SQSTM1是一种特异性的线粒体吞噬底物，是参与选择性自噬重要的接头蛋白，对于泛素化聚集体的形成及运输至关重要，能够与LC3结合通过自噬选择性降解，调节线粒体自噬活性，从而维持线粒体自噬稳态^［20-21］。本研究发现NAFLD小鼠肝组织线粒体中Drp1表达增加，芪术方可抑制Drp1在肝组织线粒体中表达，调节自噬相关蛋白Beclin-1、p62/SQSTM1、LC3，电镜中也观察到模型组中线粒体数量减少，线粒体损伤明显，可见自噬溶酶体；芪术方中、高剂量组可见自噬小体，线粒体嵴较为明显，线粒体损伤缓解。因此，芪术方治疗NAFLD的作用机制可能与调控Drp1介导的肝脏线粒体自噬相关。

综上所述，芪术方能够减轻NAFLD小鼠肝损伤，其机制与调控Drp1介导的肝脏线粒体自噬及减轻肝脏炎症有关。然而，NAFLD引发肝脏线粒体自噬，以及进一步导致肝损伤的机制尚未完全了解，还有待进一步阐述。