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芍药苷对棕榈酸诱导的HepG2细胞的保护作用及其机制
DOI: 10.12449/JCH250316
Study on the protective efect and mechanism of paeoniflorin on palmitic acid-induced HepG2 cells
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摘要:
目的 探讨芍药苷（PF）保护棕榈酸（PA）诱导的HepG2细胞的作用及机制。 方法 使用浓度为250 μmol/L的PA刺激HepG2细胞来建立非酒精性脂肪性肝病模型，浓度为10 μmol/L的Compound C作为抑制剂，浓度为25 μmol/L的PF进行干预。实验分为5组：正常组（CON组）使用完全培养基处理，模型组（MOD组）使用PA处理，PF治疗组（MOD+PF组）使用PA+PF处理，模型加抑制剂组（MOD+COM组）使用PA+Compound C处理，模型加抑制剂加PF组（MOD+COM+PF组）使用PA+Compound C+PF处理。使用试剂盒检测细胞脂质沉积指标、肝功能指标、氧化应激指标、炎症指标，油红O染色观察细胞脂质沉积情况，Western Blot法检测细胞中AMP活化蛋白激酶（AMPK）、沉默信息调节因子1（SIRT1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Beclin-1、LC3、P62蛋白表达。计量数据组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey’s检验。 结果 与MOD组相比，PF改善了细胞中TC、TG水平（P值均<0.05），降低了细胞中ALT、AST、C反应蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6水平（P值均<0.05），升高了细胞中SOD、CAT活性及GSH水平，降低了MDA水平（P值均<0.05）。油红O染色结果显示，PF减轻了细胞脂质沉积。Western Blot结果显示，与MOD相比，PF升高了p-AMPK、SIRT1、PGC-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达，降低了p-mTOR、P62蛋白表达（P值均<0.05）。 结论 PF可抑制PA诱导的非酒精性脂肪性肝病细胞模型的氧化应激和炎症反应，改善脂质沉积，促进细胞自噬，具体作用可能是通过AMPK/SIRT1/PGC-1α/mTOR信号通路来实现的。 Abstract:Objective To investigate the role and mechanism of action of paeoniflorin （PF） in protecting HepG2 cells induced by palmitic acid （PA）. Methods HepG2 cells were stimulated with PA at a concentration of 250 μmol/L to establish a NAFLD model. Compound C at a concentration of 10 μmol/L was used as an inhibitor， and PF at a concentration of 25 μmol/L was used for intervention. The experiment was divided into normal group （CON group） treated with complete culture medium， model group （MOD group） treated with PA， PF treatment group （MOD+PF group） treated with PA and PF， model+inhibitor group （MOD+COM group） treated with PA and Compound C， and model+inhibitor+PF group （MOD+COM+PF group） treated with PA， Compound C， and PF. Kits were used to measure lipid deposition indicators， liver function parameters， oxidative stress indicators， and inflammation indicators； oil red O staining was used to observe lipid deposition； Western Blot was used to measure the protein expression levels of AMPK， SIRT1， PGC-1α， mTOR， Beclin-1， LC3， and P62 in cells. The one-way analysis of variance was used for comparison of quantitative data between groups， while the Tukey’s test was used for comparison between two groups. Results Compared with the MOD group， PF improved the levels of TC and TG （P<0.05）， reduced the levels of ALT， AST， CRP， TNF-α， IL-1β， and IL-6 （P<0.05）， increased the activity of SOD and CAT and the level of GSH， and reduced the level of MDA in cells （all P<0.05）. Oil red O staining showed that PF alleviated lipid deposition in cells. Western blot results showed that compared with the MOD group， PF increased the protein expression levels of p-AMPK， SIRT1， PGC-1α， LC3Ⅱ/LC3Ⅰ， and Beclin-1 and reduced the protein expression levels of p-mTOR and P62 （all P<0.05）. Conclusion PF can inhibit PA-induced oxidative stress and inflammatory response in HepG2 cells， improve lipid deposition， and promote autophagy via the AMPK/SIRT1/PGC-1α/mTOR signaling pathway. -
Key words:
- Non-alcoholic Fatty Liver Disease /
- Paeoniflorin /
- Hep G2 Cells
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非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的特征是肝细胞脂质储存过多和脂肪变性，不包括乙醇引起的代谢应激和肝损伤及其他明确的肝细胞脂肪变性原因［1］。NAFLD的具体发病机制尚不清楚，氧化应激、炎症反应、脂肪酸的生成和氧化、自噬被认为是NAFLD的关键因素之一［2］，因此减轻氧化应激和炎症反应，保持脂质代谢平衡，改善自噬是预防和治疗NAFLD的重要策略［3］。
AMP活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）被称为能量平衡传感器，是调节肝脂质代谢的关键分子［4］。沉默信息调节因子1（silencing information regulator transcription 1，SIRT1）被上游激酶如AMPK等直接激活后，可影响下游糖、蛋白质、脂肪的合成与分解，维持ATP的动态平衡［5］。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）参与线粒体的生物合成、葡萄糖利用和脂肪酸氧化等代谢过程［6］。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target protein of rapamycin，mTOR）作为AMPK的关键下游靶点，对自噬过程具有负调控作用［7］。上述信号通路通过调节脂质合成、脂肪酸氧化和脂吞噬等过程，减少脂质沉积，从而改善NAFLD［8］。
芍药苷（paeoniflorin，PF）是芍药中的主要活性成分，具有保肝、抗炎、抗氧化、改善糖脂代谢等多种药理作用［9］，但PF改善NAFLD的作用机制尚不明确。本研究通过棕榈酸（palmitic acid，PA）诱导HepG2细胞建立NAFLD体外模型，并选择AMPK抑制剂Compound C作为工具药，探讨PF改善NAFLD的具体机制是否与AMPK/SIRT1/PGC-1α/mTOR信号通路有关。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
PF购自武汉天植生物技术有限公司，HepG2细胞购自普诺赛生命科技有限公司，PA购自上海阿拉丁生化科技有限公司，胎牛血清购自赛默飞世尔科技股份有限公司，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。油红O检测试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；总胆固醇（TC）试剂盒、甘油三酯（TG）试剂盒、ALT试剂盒、AST试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、C反应蛋白（CRP）试剂盒购于杭州联科生物技术股份有限公司。
1.2 HepG2细胞培养
HepG2细胞培养于含有10%胎牛血清1640培养基中，并在37 °C及5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
1.3 CCK-8法测定细胞增殖
根据CCK-8细胞增殖试剂盒的说明进行操作。HepG2细胞（5×103个/孔）接种在96孔板上，加入不同浓度的含PF和PA培养基继续培养24 h。加入CCK-8试剂，培养箱中孵育后测量吸光度。
1.4 PA溶液的制备
0.030 72 g PA加入3 mL浓度为0.1 m/L的NaOH溶液中，在70 ℃的水浴中充分溶解来制备40 mmol/L PA溶液；1.2 g BSA加入3 mL水中，离心至完全溶解来制备40% BSA溶液；取3 mL PA溶液在37 ℃水浴中滴加至3 mL 40% BSA溶液中，过滤除菌，得到20 mmol/L PA母液，将上述PA母液加入培养基稀释为浓度0.25 mmol/L，4 ℃储存备用。
1.5 细胞与实验设计
细胞分为5组：正常组（CON组）使用完全培养基培养，模型组（MOD组）使用含有PA的完全培养基培养，PF治疗组（MOD+PF组）使用含有PA+PF的完全培养基培养，模型加抑制剂组（MOD+COM组）使用PA+Compound C的完全培养基培养，模型加抑制剂加PF组（MOD+COM+PF组）使用含有PA+Compound C+PF的完全培养基培养［10］。PF浓度为25 μmol/L，PA浓度为250 μmol/L，Compound C浓度为10 μmol/L。Compound C是一种选择性、ATP竞争性的AMPK抑制剂，在细胞实验中被广泛用于阻断AMPK有关通路［11］。上述细胞培养24 h后，收集细胞和培养液进行后续检测。
1.6 HepG2细胞蛋白的提取和测定
弃去培养液，加入PBS清洗细胞。洗净后加入裂解液、抑制剂等，冰浴裂解细胞。使用细胞刮刮下细胞，然后用枪将刮下的细胞混悬液移至离心管中并反复吹打，于4 ℃离心。将离心后的上清分装，置于-80 ℃保存备用。使用BCA试剂盒，检测各组OD值，根据说明书计算出各组蛋白的浓度。
1.7 HepG2细胞中TC、TG的检测
根据试剂盒说明书，按顺序依次加入蒸馏水、校准品、样本和工作液。混匀，37 ℃孵育10 min，波长500 nm，酶标仪测定各孔吸光度值，公式计算出HepG2细胞中TC、TG水平。
1.8 HepG2细胞中油红O染色检测
移除细胞培养基，PBS清洗后，加油红O固定液固定30 min。弃去固定液，用蒸馏水洗2次，加入60%异丙醇浸洗30 s。弃去60%异丙醇后加入新配制好的油红O染色液，浸染10～20 min。弃去染色液，60%异丙醇漂洗30 s后，水洗3次，加入Mayer苏木素染色液，复染细胞核1～2 min。弃去染液后水洗3次，加入油红O缓冲液孵育1 min，弃去。加入蒸馏水覆盖细胞并在显微镜下观察。
1.9 HepG2细胞培养液中ALT、AST的检测
根据说明书加入ALT基质液、2，4-二硝基苯肼盐酸溶液、NaOH溶液，用多功能微孔板读数仪检测OD值，根据说明书提供的计算公式计算出ALT、AST的水平。
1.10 HepG2细胞中SOD、MDA、CAT、GSH的检测
根据试剂盒说明书，用制备好的细胞匀浆检测SOD、CAT活性及MDA、GSH水平。
1.11 HepG2细胞培养液中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6的检测
准备所需试剂和样本，加入洗液静置浸泡酶标板。弃掉洗液之后拍干，立即根据试剂盒说明书加入标准品、样本和检测抗体。封板膜封板，振荡，室温孵育，弃液洗涤。每孔添加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，再次封板，室温震荡孵育，再次洗涤。添加显色底物，室温避光孵育20 min后，添加终止液。酶标仪测定OD值，依据标准曲线计算对应TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平。
1.12 HepG2细胞中蛋白表达的检测
在细胞中添加RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸化蛋白酶抑制剂对细胞进行裂解。离心后，提取上清液以制备蛋白质样品。样品加入凝胶进行电泳，然后将蛋白质转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭后，将PVDF膜与以下抗体孵育，4 ℃过夜：p-AMPK、AMPK、SIRT1、PGC-1α、mTOR、p-mTOR、LC3、Beclin-1、P62和GAPDH。清洗一抗后，将膜与相应的二抗孵育，曝光。使用Vision Capt软件对获得的条带进行分析。
1.13 统计学方法
所得计量数据由GraphPad Prism 10和Vision Capt等软件进行数据分析及图像处理，结果以
2. 结果
2.1 PF和PA对HepG2细胞活性的影响
如图1所示，浓度范围0～25 μmol/L的PF不会显著抑制细胞活力；浓度在250 μmol/L的PA明显抑制了50%的细胞活力（P<0.05）。因此，在后续实验中，使用PF浓度为25 μmol/L、PA浓度为250 μmol/L作用于细胞。
2.2 PF对PA诱导的HepG2细胞中TC、TG的影响
如图2所示，与CON组相比，MOD组TC、TG水平明显升高（P值均<0.05）。PF治疗后，MOD+PF组TC、TG水平明显低于MOD组（P值均<0.05）。给予Compound C后，MOD+COM组和MOD+COM+PF组相比差异无统计学意义（P值均>0.05），表明PF的改善脂代谢作用被抑制。
2.3 PF对PA诱导的HepG2细胞培养液中肝功能指标的影响
如图3所示，与CON组相比，MOD组ALT、AST水平均显著升高（P值均<0.05）。PF治疗后，MOD+PF组ALT、AST水平明显低于MOD组（P值均<0.05）。MOD+COM组和MOD+COM+PF组相比，差异无统计学意义，表明PF的肝保护作用被抑制（P值均>0.05）。
图 3 PF对HepG2细胞培养液中肝功能指标的影响Figure 3. PF on liver function indicators in HepG2 cell culture medium2.4 PF对PA诱导的HepG2细胞培养液中炎性细胞因子的影响
如图4所示，与CON组相比，MOD组TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平显著升高（P值均<0.05）。PF治疗后，MOD+PF组TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平显著低于MOD组（P值均<0.05）。给予Compound C后，MOD+COM组和MOD+COM+PF组相比，差异无统计学意义（P值均>0.05），表明PF的抗炎作用被抑制。
图 4 PF对HepG2细胞培养液中炎性细胞因子的影响Figure 4. PF on inflammatory cytokines in HepG2 cell culture medium2.5 PF对PA诱导的HepG2细胞中氧化应激指标的影响
如图5所示，与CON组相比，MOD组中SOD、CAT活性及GSH水平明显降低，MDA水平显著增加（P值均<0.05）。PF治疗后，MOD+PF组SOD、CAT活性及GSH水平增加，MDA水平降低（P值均<0.05）。给予Compound C后，MOD+COM组和MOD+COM+PF组相比，差异无统计学意义（P值均>0.05），表明PF的抗氧化作用被抑制。
2.6 PF对PA诱导的HepG2细胞中脂质沉积的影响
如图6所示，与CON组相比，MOD组细胞中脂滴被大面积红染。PF治疗后，MOD+PF组的红染面积明显减少，表明PF改善了脂质沉积。给予Compound C后，PF的减轻脂质沉积作用被抑制。
2.7 PF对PA诱导的HepG2细胞中AMPK/SIRT1/PGC-1α通路的影响
如图7所示，与CON组相比，MOD组中p-AMPK、SIRT1、PGC-1α表达量显著降低（P值均<0.05）。PF治疗后，MOD+PF组p-AMPK、SIRT1、PGC-1α表达量显著高于MOD组（P值均<0.05）。给予Compound C后，MOD+COM组和MOD+COM+PF组相比，差异无统计学意义（P值均>0.05），表明PF激活AMPK改善脂质沉积的作用被抑制。
图 7 PF对HepG2细胞中AMPK/SIRT1/PGC-1α通路的影响Figure 7. PF on the AMPK/SIRT1/PGC-1α pathway in HepG2 cells2.8 PF对PA诱导的HepG2细胞中AMPK/mTOR/LC3/P62/Beclin-1通路的影响
如图8所示，与CON组相比，MOD组p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达降低，p-mTOR、P62表达显著升高（P值均<0.05）。PF治疗后，MOD+PF组p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达显著升高，p-mTOR、P62表达显著降低（P值均<0.05）。给予Compound C后，MOD+COM组和MOD+COM+PF组相比，差异无统计学意义（P值均>0.05），表明PF激活AMPK，改善自噬的作用被抑制。
图 8 PF对HepG2细胞中AMPK/mTOR/LC3/P62/Beclin-1通路的影响Figure 8. Effects of PF on the AMPK/mTOR/LC3/P62/Beclin-1 pathway in HepG2 cells3. 讨论
NAFLD发病机制复杂，可能由多种因素引起，包括肝脏中摄取过多的游离脂肪酸、氧化应激、炎症反应、自噬受损和内质网应激等［12］。有研究显示，肝内脂质沉积可诱发氧化应激导致活性氧大量产生，线粒体功能障碍，从而加剧肝细胞脂肪变性和炎症，导致NAFLD发生发展［13］。PA是一种饱和脂肪酸，通常用于建立细胞脂肪变性模型，HepG2细胞经PA处理后，表现出过度的脂质积聚，这是肝细胞脂肪变性的特征［14］。本研究结果表明，250 μmol/L的PA诱导HepG2细胞后出现TC、TG水平的增加，油红O染色显示大量红染脂滴，肝细胞炎性因子指标TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP上调，以及氧化应激指标MDA上调，SOD、CAT、GSH下调，成功建立了NAFLD细胞脂肪变性模型。
白芍具有柔肝止痛、平抑肝阳等作用，临床常用来治疗NAFLD，PF作为其主要化学成分，具有保肝、抗炎、抗氧化、改善糖脂代谢等多种药理作用［9］。本研究结果显示，在给予PF治疗后，PF下调了细胞ALT和AST活性，降低了TC、TG、TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平，下调了MDA水平，上调了SOD、CAT活性及GSH水平，这表明PF可以改善PA诱导的HepG2细胞脂质沉积，减轻炎症，改善氧化应激反应，保护细胞。
AMPK是一种结构为异源三聚体的蛋白激酶，是机体维持细胞内能量平衡、调控全身能量代谢的一种关键分子，并在体内AMP/ATP比例升高时被激活。研究表明，AMPK通过磷酸化Thr172位点被激活，从而减轻NAFLD肝细胞内脂质沉积和氧化应激、炎症反应等［15-16］。SIRT1是一种依赖于NAD+的去乙酰化酶，可促使多种蛋白质的赖氨酸残基发生去乙酰化，促进体内脂类物质的动员［17］。PGC-1α广泛存在于富含线粒体的组织，通过激活脂肪酸β氧化、线粒体呼吸关键酶等参与脂代谢，改善NAFLD［18］。研究显示，AMPK可增强SIRT1和PGC-1α活性，从而调控线粒体的生物合成和能量代谢，促进脂肪酸的氧化，减少肝脂质沉积，减轻氧化应激和炎症反应，从而达到改善NAFLD的作用［19］。本研究结果显示，PF通过激活AMPK通路与SIRT1，上调PGC-1α，改善了细胞脂质沉积，减轻了氧化应激和炎症反应。
细胞自噬参与多种疾病的发生和发展，同时也是代谢性疾病作用的靶点之一［20-21］。AMPK/mTOR通路是与细胞自噬有关的重要信号通路［22］。AMPK是激活自噬的关键调控因子，可抑制mTOR活性，增强自噬［23］。LC3Ⅱ作为一个衔接蛋白，与P62自噬蛋白相互作用，允许自噬小体吞噬底物；Beclin-1是自噬蛋白磷脂酰肌醇3-激酶复合物的组成部分，参与调控自噬体的形成［24］。经PF治疗后，p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达升高，p-mTOR、P62表达显著降低，表明PF可以改善PA诱导的HepG2细胞自噬。
Compound C是与ATP结合位点竞争的选择性小分子AMPK抑制剂，在细胞实验中被广泛用作阻断与AMPK有关通路的抑制剂［11］。研究表明，AMPK通路被阻断可影响下游相关蛋白的表达［25］。在本实验中，HepG2细胞经Compound C与PA联合处理后，AMPK相关通路并未被激活，自噬、氧化应激、炎症反应和脂代谢未被改善。HepG2细胞经PA和PF联合处理后，AMPK相关信号通路被激活，上述指标明显改善，进一步表明PF通过AMPK通路来发挥相关作用。
综上，PF可以改善HepG2细胞氧化应激、炎症、脂质沉积和自噬等，具体机制可能与调控AMPK/SIRT1/PGC-1α/mTOR信号通路有关。本研究从体外实验进一步证实PF改善NAFLD疗效及机制，为NAFLD的新药开发和应用提供了实验依据。
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图 3 PF对HepG2细胞培养液中肝功能指标的影响
Figure 3. PF on liver function indicators in HepG2 cell culture medium
图 4 PF对HepG2细胞培养液中炎性细胞因子的影响
Figure 4. PF on inflammatory cytokines in HepG2 cell culture medium
图 7 PF对HepG2细胞中AMPK/SIRT1/PGC-1α通路的影响
Figure 7. PF on the AMPK/SIRT1/PGC-1α pathway in HepG2 cells
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