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Go-ichi-ni-san复合物亚基1（GINS1）对肝细胞癌进展和化疗耐药的影响
DOI: 10.12449/JCH250314
Effect of Go-Ichi-Ni-San complex subunit 1 on disease progression and chemotherapy resistance in hepatocellular carcinoma
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摘要:
目的 探究Go-ichi-ni-san复合物亚基1（GINS1）在肝细胞癌（HCC）进展和化疗耐药中的作用及相关机制。 方法 通过肿瘤数据库GEPIA2网站检索并分析GINS1在HCC患者和健康人群中的表达差异。收集2017年5月—2021年1月新疆医科大学附属肿瘤医院及第一附属医院收治的40例HCC患者病理组织，通过免疫组化染色检测GINS1在HCC组织和对应癌旁组织中的表达差异，分析GINS1表达水平与HCC临床TNM分期之间的关系。Western Blot检测GINS1在HCC细胞系Huh7、Hep3B、Li-7、MHCC97H和人正常肝细胞系QSG7701中的表达差异。通过慢病毒转染细胞的方法构建稳定敲低GINS1的MHCC97H细胞株及其阴性对照细胞株。通过CCK-8实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力，划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell实验检测细胞侵袭能力，使用奥沙利铂处理细胞以检测细胞对化疗药物的敏感性。构建裸鼠负瘤模型，观察GINS1敲低对HCC体内生长的影响。Western Blot检测各组细胞Notch通路和JAK/STAT通路蛋白表达水平。加入Notch受体激动剂Jagged-1处理细胞，分析GINS1与Notch/JAK/STAT通路之间的关系。计量资料两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 GINS1在HCC患者、HCC组织和HCC细胞系中均表达上调（P值均<0.05）。GINS1表达水平与HCC临床TNM分期正相关（r=0.822，P=0.011）。与阴性对照组细胞相比，敲低GINS1的MHCC97H细胞增殖、迁移和侵袭活性均降低（P值均<0.01），对奥沙利铂敏感性增强（P<0.01）。与对照组裸鼠相比，GINS1敲低导致裸鼠形成的肿瘤质量和体积均受到显著抑制（P值均<0.001）。与阴性对照组细胞相比，在敲低GINS1的MHCC97H细胞内，Notch1、Notch3、p-JAK2和p-STAT3表达水平明显降低（P值均<0.05），JAK2和STAT3总体表达水平无明显差异（P值均>0.05）。Jagged-1处理后，敲低GINS1的MHCC97H细胞的增殖、迁移和侵袭活性均有所增加，而细胞对奥沙利铂敏感性有所减弱，p-JAK2、p-STAT3水平升高（P值均<0.05）。 结论 GINS1在HCC中表达上调，并且能够通过Notch/JAK2/STAT3通路促进HCC进展和肿瘤细胞化疗耐药。 Abstract:Objective To investigate the role and mechanism of Go-Ichi-Ni-San complex subunit 1 （GINS1） in the progression of hepatocellular carcinoma （HCC） and the development of chemotherapy resistance. Methods The tumor database GEPIA2 was used to analyze the differential expression of GINS1 between HCC patients and healthy individuals， and pathological tissue samples were collected from 40 HCC patients who were admitted to The Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University and the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from May 2017 to January 2021. Immunohistochemical staining was used to measure the difference in the expression of GINS1 between HCC tissue and corresponding adjacent tissue， and the correlation between the expression level of GINS1 and the clinical TNM stage of HCC was analyzed. Western blot was also used to measure the difference in the expression of GINS1 between HCC Huh7/Hep3B/Li-7/MHCC97H cell lines and normal human QSG7701 hepatocytes. The method of lentivirus transfection was used to establish the MHCC97H cell line with stable GINS1 knockdown and its negative control cell line. CCK-8 assay and colony formation assay were used to measure cell proliferative capacity； scratch assay was used to measure cell migration ability； Transwell assay was used to measure cell invasion ability； cells were treated with oxaliplatin to measure their sensitivity to chemotherapy drugs. Nude mice were used to establish a tumor-bearing model and observe the effect of GINS1 knockdown on the growth of HCC in vivo. Western Blot was used to measure the expression levels of the proteins associated with the Notch pathway and the JAK/STAT pathway. The cells were treated with the Notch receptor agonist Jagged-1 to analyze the association between GINS1 and the Notch/JAK/STAT pathway. The independent-samples t test was used for comparison of continuous data between two groups； a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results The expression of GINS1 was upregulated in HCC patients， HCC tissue， and HCC cell lines （all P<0.05）， and the expression level of GINS1 was positively correlated with the clinical TNM stage of HCC （r=0.822， P=0.011）. Compared with the negative control cells， the GINS1-knockdown MHCC97H cells showed significant reductions in proliferation， migration， and invasion activities （all P<0.01） and a significantly enhanced sensitivity to oxaliplatin （P<0.01）. Compared with the nude mice in the control group， GINS1 knockdown caused significant inhibition of tumor weight and volume in vivo in nude mice （all P<0.001）. Compared with the negative control cells， the GINS1-knockdown MHCC97H cells showed significant reductions in the expression levels of Notch1， Notch3， p-JAK2， and p-STAT3 （all P<0.05）， while there were no significant differences in the overall expression levels of JAK2 and STAT3 （P>0.05）. After Jagged-1 treatment， the GINS1-knockdown MHCC97H cells showed significant increases in proliferation， migration， and invasion activities and a significant reduction in sensitivity to oxaliplatin， as well as significant increases in the levels of p-JAK2 and p-STAT3 （all P<0.05）. Conclusion GINS1 is upregulated in HCC and can promote HCC progression and chemotherapy resistance through the Notch/JAK2/STAT3 pathway. -
肝细胞癌（HCC）是全球最常见的癌症之一。与其他常见癌症（如乳腺癌、肺癌和前列腺癌）的相比，HCC的死亡率每年持续增加2%～3%，这是因为HCC患者确诊时往往处于晚期，而且晚期HCC尚无治愈方法［1］。HCC的早期诊断正成为一个巨大的挑战。在过去的几年里，HCC的早期诊断依赖于超声监测和甲胎蛋白血清学评估［2］。然而，这两种方法的特异性和敏感性不足以准确地诊断出早发性HCC［3］。因此，找到HCC早期诊断特异性靶点至关重要。Go-ichi-ni-san复合物亚基1（GINS1）属于异四聚体复合物GINS的一部分［4］。研究表明，酵母中的GINS复合物能够与其他分子组装成更大的复合物来参与调节细胞周期的每个阶段和DNA复制过程［5］。GINS复合物与哺乳动物细胞中参与DNA复制的蛋白质结合，以协助DNA复制过程［6］。GINS1是GINS复合物中的关键组成部分，在整个细胞周期中维持细胞增殖活性［7-9］。先前的研究发现，在人类多种肿瘤中GINS1水平升高，例如胶质瘤、乳腺癌和膀胱癌［7，10-11］。然而，其在HCC发展中的作用尚不清楚。本研究通过构建稳定敲低GINS1的HCC细胞系，初步探究了GINS1对HCC进展的促进作用及相关分子机制。
1. 材料和方法
1.1 细胞系、实验动物和病理组织切片
人HCC细胞系Huh7、Hep3B、Li-7、MHCC97H购自武汉普诺赛生物公司，人正常肝细胞系QSG7701购自合肥万物生物公司。所有细胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基，在含5% CO2的37 ℃孵箱内培养。12只4周龄BALB/C雄性裸鼠购自北京斯贝福生物公司，饲养于医院洁净动物房内。40例HCC患者（T1～T4期各10例）病理组织切片及对应癌旁组织切片来自新疆医科大学附属肿瘤医院及第一附属医院，样本收集前患者均未接受新辅助化疗。
1.2 生物信息学分析
通过检索GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）数据库，获得GINS1在HCC患者和健康人群中的表达情况，下载差异表达结果图。
1.3 免疫组化染色
本课题组委托上海奥特多生物科技公司制作了组织微阵列（tissue microarray， TMA），该阵列包含40个HCC组织样本和40个对应癌旁组织样本，这些样本收集于2017年5月—2021年1月。TMA切片用乙醇水化，然后用澄清剂二甲苯使其透明，再嵌入石蜡中。然后使用H2O2抑制内源性过氧化物酶功能。按照制造商的指示孵育一抗和二抗。使用倒置显微镜观察每张载玻片。免疫组化染色评估由两名经验丰富的病理学家独立进行。测量肿瘤组织中免疫染色的强度用于评估GINS1表达，阳性信号被描述为深棕色。
1.4 Western Blot检测
对于细胞样本，将细胞接种于6孔板内，长满后用含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液（上海碧云天公司）裂解细胞获得总蛋白。蛋白在金属浴中煮沸变性，然后通过SDS-PAGE凝胶电泳分离，再转移到聚偏二氟乙烯膜（美国Millipore公司）上。使用5%脱脂牛奶封闭膜2 h，膜与一抗在4 ℃下孵育过夜。用PBS冲洗膜3次，膜与二抗在室温下孵育1 h。最后，使用ECL化学发光液对蛋白条带进行显影。对于组织样本，首先将组织切成小块，按每30 mg组织需100 μL裂解液的比例，使用裂解液裂解组织，然后组织在冷冻研磨机上充分研磨。将组织匀浆静置10 min，取上清用以后续试验。抗GAPDH、GINS1、Notch1、Notch3抗体购自美国Proteintech公司，抗Bax、Bad、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3抗体购自美国abcam公司，羊抗兔和羊抗鼠二抗购自上海碧云天公司。
1.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
使用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取细胞RNA，使用SuperScript Ⅳ试剂盒（美国Thermo Fisher公司）将RNA逆转录合成cDNA，在CFX96 PCR仪（美国Bio-Rad公司）上使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒（南京Vazyme公司）对cDNA进行RT-qPCR分析。以GAPDH基因转录水平归一化处理各基因转录水平。各基因引物序列见表1。
表 1 qRT-PCR引物序列Table 1. Primer sequences for qRT-PCR基因 序列（5'-3'） GAPDH 上游：CTCACCGGATGCACCAATGTT
下游：CGCGTTGCTCACAATGTTCAT
GINS1 上游：ACGAGGATGGACTCAGACAAG
下游：TGCAGCGTCGATTTCTTAACA
1.6 CCK-8增殖实验
将细胞以5 000个/孔的密度均匀接种在96孔板中。分别在第12、24、48和72 h向每孔加入10 μL CCK-8试剂（上海碧云天公司），继续避光孵育2 h，并使用多功能微孔板读数仪（新加坡PerkinElmer公司）测量450 nm处的吸光度。
1.7 克隆形成实验
将细胞按500个/孔的密度接种于6孔板内，完全培养基连续培养。待肉眼可见有明显的细胞集落形成时，撤去培养基，PBS洗涤3次，用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色细胞，PBS洗涤3次后，在显微镜下观察并计数细胞集落数量。
1.8 划痕实验
将细胞接种于6孔板内，待细胞汇合度达60%时，撤去培养基，用10 μL移液枪头对细胞进行十字划痕，制造直线“缺口”。以无血清培养基继续培养，分别在划痕后0 h和48 h显微镜下观察“缺口”面积变化。
1.9 Transwell侵袭实验
对于Transwell侵袭实验，在冰上操作铺好Matrigel胶。在24孔Transwell板（美国Corning公司）下室中加入含有20%胎牛血清的完全培养基，上室中加入含有1 000个细胞的无血清培养基。孵育48 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色，使用显微镜对侵袭细胞进行定量分析。
1.10 化疗耐药敏感性检测
将HCC细胞接种于96孔板中，加入终浓度为0、0.1、1、10、50、100 μmol/L的奥沙利铂药物（美国MCE公司），处理细胞48 h。使用CCK-8试剂盒测定细胞活性，计算半数生长抑制率（IC50），使用GraphPad Prism 8.0软件进行分析，比较不同处理细胞IC50值变化。以35 μmol/L浓度的奥沙利铂培养细胞，观察细胞敏感性变化。
1.11 慢病毒转染细胞
包含GINS1基因表达干扰质粒（shGINS1-#1，shGINS1-#2，shGINS1-#3）及其阴性对照质粒（shNC）的慢病毒载体购自上海吉玛基因公司。按照说明，将细胞按5 000个/孔的密度接种于24孔板内，分为GINS1敲低组和敲低阴性对照组，根据分组分别加入对应的慢病毒-培养基混合液。病毒侵染细胞24 h后撤去培养基，更换为新鲜完全培养基。48 h后使用含10 mg/mL嘌呤霉素（上海碧云天公司）的完全培养基培养各组细胞，3天后存活细胞即为成功转染了慢病毒的细胞。人类GINS1基因表达干扰质粒中短发夹RNA（short hairpin RNA， shRNA）序列见表2。
表 2 shRNA序列Table 2. shRNA sequenceshRNA 序列（5'-3'） shGINS1-#1 CCGGCAAGTTCTGGAGGAGATGAAACTCGAGTTTCATCTCCTCCAGAACTTGTTTTTT shGINS1-#2 CCGGGAGGAGATGAAAGCTTTGTATCTCGAGATACAAAGCTTTCATCTCCTCTTTT shGINS1-#3 CCGGACCACTGTTCTCTGTTAAGAACTCGAGTTCTTAACAGAACAGTGTCTTTTTT 1.12 裸鼠负瘤模型
12只裸鼠来自北京斯贝福生物公司［生产许可证号：SCXK（京）2019-0010，合格证号：1100111911047350］，体质量20～22 g。裸鼠在SPF级环境中适应性饲养1周，环境相对湿度为62%～70%，温度为（23±1.5）℃，12 h/12 h间断照明，提供充足饲料和无菌水，自由饮食。在随机分配为GINS1敲低组和对照组（每组各6只）后，使用注射器在无菌环境中将细胞（2×106个/只）注射到裸鼠背部。肿瘤细胞接种第21天从裸鼠身上取下肿瘤样本，称重、拍照并记录。肿瘤体积计算公式：V=（长×宽2）/2（mm3）。
1.13 统计学方法
使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。计量资料以
2. 结果
2.1 GINS1在HCC中表达上调
GEPIA2数据库检索结果显示，GINS1在HCC患者中的表达水平显著高于健康人群（图1a）。随后，在细胞层面进行的蛋白免疫印迹分析结果表明，GINS1蛋白在4种人类HCC细胞系中的表达水平均显著高于人正常肝细胞系QSG7701（Huh7：t=5.56，P=0.020；Hep3B：t=7.70，P=0.014；MHCC97H：t=8.62，P=0.010；Li-7：t=6.81，P=0.018），并且在具有高转移潜能的MHCC97H细胞中表达水平最高（P=0.010）（图1b）。为了验证细胞实验结果，本研究对包含40例HCC组织样本和对应癌旁组织样本的TMA进行免疫组化染色。结果表明，与癌旁组织相比，GINS1在HCC组织中表达水平显著上调（P=0.003）（图1c）。对T1～T4期HCC组织进行蛋白印迹分析显示，GINS1表达水平与HCC的T分期正相关（r=0.822，P=0.011））（图1d）。上述结果提示，GINS1高水平表达可能是促进HCC发生和发展的重要因素。
注： a，生物信息学分析GINS1在HCC患者和健康人群中的表达差异；b，Western Blot检测GINS1在4种HCC细胞系和1种正常肝细胞系QSG7701中的表达差异；c，免疫组化分析GINS1在HCC组织和对应癌旁组织中的表达差异（×200）；d，Western Blot检测不同HCC临床TNM分期（T1～T4）GINS1表达水平。图 1 GINS1在HCC中表达上调Figure 1. GINS1 expression level is upregulated in HCC2.2 下调GINS1表达抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭活性
为了探究GINS1在HCC发生和发展过程中的作用，本研究构建了稳定敲低GINS1的MHCC97H细胞株（shGINS1-#1，shGINS1-#2，shGINS1-#3）及其阴性对照细胞株（shNC）。Western Blot和qRT-PCR结果表明，shGINS1-#3敲低效率最佳（P<0.001），所以后续GINS1敲低细胞株均为转染了shGINS1-#3的MHCC97H细胞株（图2a、b）。CCK-8增殖实验和克隆形成实验结果显示，与对照组相比，shGINS1-MHCC97H组细胞增殖活性显著降低（P值均<0.01）（图2c、d）。本研究随后分析了GINS1敲低对MHCC97H细胞迁移和侵袭能力的影响。划痕实验结果表明，shGINS1-#3组细胞的迁移能力显著弱于shNC组细胞（P<0.01）（图2e）；Transwell实验结果显示，shGINS1-#3组细胞在48 h内发生侵袭的细胞数量显著少于shNC组细胞（P<0.01）（图2f）。这些结果表明，GINS1的表达能够促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭。
注： a、b，通过Western Blot和qRT-PCR验证GINS1敲低效率；c、d，通过CCK-8实验和克隆形成实验检测细胞增殖活性，**P<0.01，***P<0.001；e，划痕实验检测细胞迁移能力；f，Transwell实验检测细胞侵袭能力（×100）。图 2 下调GINS1表达抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭活性Figure 2. Knockdown of GINS1 expression inhibited the proliferation， migration， and invasion activities of HCC cells2.3 GINS1表达缺失增强奥沙利铂对HCC细胞的凋亡诱导作用
为了探究GINS1的表达是否与HCC细胞化疗耐药性的产生相关，本研究使用不同浓度梯度奥沙利铂处理MHCC97H细胞。如图3a所示，shGINS1-#3组细胞对奥沙利铂敏感性增强，IC50值低于shNC细胞（P<0.01）。随后，以35 μmol/L奥沙利铂分别培养上述两组细胞24 h。Western Blot检测结果显示，与shNC组相比，shGINS1-#3组细胞内凋亡蛋白Bax和Bad表达水平显著升高（P值均<0.001）（图3b）。这说明，GINS1的表达有利于HCC细胞对奥沙利铂化疗药物抗性的形成，GINS1表达缺失增强了奥沙利铂对HCC细胞的凋亡诱导作用。
注： a，CCK-8法测定细胞对奥沙利铂药物IC50；b，Western Blot检测细胞凋亡蛋白表达水平。图 3 GINS1表达缺失增强奥沙利铂对HCC细胞的凋亡诱导作用Figure 3. Loss of GINS1 expression enhanced the apoptosis induction of oxaliplatin in HCC cells2.4 GINS1敲低抑制了HCC肿瘤体内生长
为了验证体外实验的结果，本研究构建了裸鼠HCC负瘤模型。在接种肿瘤细胞第21天处死动物，完整取下肿瘤，观察到GINS1敲低组裸鼠形成的肿瘤质量和体积均显著小于对照组（P值均<0.001）（图4）。
2.5 GINS1通过Notch/JAK2/STAT3通路促进HCC进展和奥沙利铂耐药
Notch通路和JAK/STAT通路的异常表达与HCC的进展密切相关。与shNC组细胞相比，在shGINS1-#3组细胞内，Notch通路中的Notch1、Notch3受体蛋白表达水平显著降低（P值均<0.001），JAK/STAT通路中的JAK2、STAT3蛋白总体表达水平无显著差异，而p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平显著降低（P值均<0.001）（图5a）。加入10 μg/mL的Notch受体激动剂Jagged-1后，发现shGINS1-MHCC97H组细胞p-JAK2、p-STAT3表达水平均有所升高（P值均<0.01）（图5b），提示JAK2/STAT3通路受到Notch信号的直接调控。此外，克隆形成实验结果显示，10 μg/mL的Jagged-1有效增强了shGINS1-MHCC97H组细胞增殖活性（P<0.01）（图5c）。而划痕实验和Transwell侵袭实验进一步发现，在Jagged-1作用下，因GINS1敲低而导致的MHCC97H细胞迁移和侵袭活性抑制得到部分逆转（P值均<0.01）（图5d、e）。最后，以35 μmol/L奥沙利铂培养细胞24 h，Western Blot检测发现添加Jagged-1的shGINS1-MHCC97H组细胞凋亡蛋白Bax和Bad表达水平均显著低于未添加Jagged-1的shGINS1-MHCC97H组细胞（P值均<0.01）（图5f）。以上结果表明，GINS1对HCC增殖、迁移、侵袭和耐药性形成的作用是通过Notch/JAK2/STAT3通路介导的。
注： a，Western Blot检测结果；b～f，加入Notch受体激动剂Jagged-1后，通过Western blot（b）检测Jagged-1对shGINS1-MHCC97H组细胞JAK2/STAT3通路磷酸化水平的影响，克隆形成实验（c）检测细胞增殖活性变化，划痕实验（d）检测细胞迁移能力变化，Transwell实验（e）检测细胞侵袭能力变化（×100），35 μmol/L奥沙利铂培养（f）检测细胞凋亡情况。图 5 GINS1通过Notch/JAK2/STAT3通路促进HCC进展和奥沙利铂耐药Figure 5. GINS1 promoted HCC progression and oxaliplatin resistance through the Notch/JAK2/STAT3 pathway3. 讨论
HCC发病率和病死率均较高，通常预后不良，全球每年有近60万人死于该病［12-13］。因此，寻找HCC早期诊断和靶向治疗的特异性标志物有重要意义。
GINS1是四聚体复合物GINS的一部分，其编码基因在进化上非常保守。它是复制解旋酶机制的组成部分，并被认为参与DNA复制。研究发现，GINS1的缺失导致内细胞团增殖受损，造成胚胎死亡［14］。多项研究表明，GINS1不仅在正常细胞中有重要作用，而且在癌细胞中也发挥作用。GINS复合物在乳腺癌、肺癌等肿瘤中被发现高表达，并且GINS1高转录活性与肿瘤细胞高增殖和转移活性、高转移潜能相关［15］。在本研究中，GINS1被证明在HCC患者、HCC组织和HCC细胞系中高表达，并且促进HCC进展和化疗耐药。
研究发现，Notch信号通路在进化上较为保守，Notch受体（Notch1～4）经过三次剪切后转位至细胞核内调控靶基因的转录［16］。Notch信号深度参与多种组织器官的发育和稳态，异常表达可导致癌性和非癌性疾病的发生。但近期研究表明，Notch信号的结果是多变的，且高度依赖于环境。Notch信号既可以促进多种癌症的发展，也可以抑制肿瘤进展［17］。据报道，Notch1的表达上调可以增强HCC细胞干性和化疗耐药性［18］。另外，Notch1受体的激活可以引发肝祖细胞驱动的HCC发生和肿瘤肺转移［19］。Notch3受体在HCC中表达异常，并且与患者低生存率相关［20-21］。多项研究发现，抑制Notch3可以有效增强化疗药物对HCC的治疗作用［22-24］。因此，Notch1和Notch3受体在HCC中均展现出重要作用。
JAK非受体酪氨酸激酶家族由四种蛋白质组成：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。STAT蛋白是JAK下游信号分子。STAT家族成员包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6。JAK/STAT信号通路是细胞内普遍表达的信号转导通路，参与细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节等许多重要的生物学过程［25-26］。多项研究表明，JAK/STAT信号通路与HCC发生和发展相关。使用干扰素-α（IFN-α）来驱动宿主的抗病毒反应是目前治疗慢性乙型肝炎的一线方法，并已被证实可以减缓肝纤维化的进展，甚至延缓HCC的发生。作为一种重要的免疫相关细胞因子，IFN-α可激活JAK/STAT信号，诱导各种具有抗病毒和免疫调节功能的IFN刺激基因［27］。此外，由外来信号引起的HCC细胞内JAK2/STAT3通路的激活能够促进HCC进展［28］。在本研究中，GINS1的表达被证明能够通过激活JAK2/STAT3通路促进HCC进展和化疗耐药。
总之，本研究进一步证实了GINS1在HCC中的关键作用，并且与Notch/JAK2/STAT3通路的激活相关。这些发现可能为临床HCC诊治提供新的思路。然而，由于本研究缺少关于GINS1过表达的相关实验，因此GINS1在HCC发生和发展中的作用还需要进一步探索。
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注： a，生物信息学分析GINS1在HCC患者和健康人群中的表达差异；b，Western Blot检测GINS1在4种HCC细胞系和1种正常肝细胞系QSG7701中的表达差异；c，免疫组化分析GINS1在HCC组织和对应癌旁组织中的表达差异（×200）；d，Western Blot检测不同HCC临床TNM分期（T1～T4）GINS1表达水平。
图 1 GINS1在HCC中表达上调
Figure 1. GINS1 expression level is upregulated in HCC
注： a、b，通过Western Blot和qRT-PCR验证GINS1敲低效率；c、d，通过CCK-8实验和克隆形成实验检测细胞增殖活性，**P<0.01，***P<0.001；e，划痕实验检测细胞迁移能力；f，Transwell实验检测细胞侵袭能力（×100）。
图 2 下调GINS1表达抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭活性
Figure 2. Knockdown of GINS1 expression inhibited the proliferation， migration， and invasion activities of HCC cells
注： a，CCK-8法测定细胞对奥沙利铂药物IC50；b，Western Blot检测细胞凋亡蛋白表达水平。
图 3 GINS1表达缺失增强奥沙利铂对HCC细胞的凋亡诱导作用
Figure 3. Loss of GINS1 expression enhanced the apoptosis induction of oxaliplatin in HCC cells
注： a，Western Blot检测结果；b～f，加入Notch受体激动剂Jagged-1后，通过Western blot（b）检测Jagged-1对shGINS1-MHCC97H组细胞JAK2/STAT3通路磷酸化水平的影响，克隆形成实验（c）检测细胞增殖活性变化，划痕实验（d）检测细胞迁移能力变化，Transwell实验（e）检测细胞侵袭能力变化（×100），35 μmol/L奥沙利铂培养（f）检测细胞凋亡情况。
图 5 GINS1通过Notch/JAK2/STAT3通路促进HCC进展和奥沙利铂耐药
Figure 5. GINS1 promoted HCC progression and oxaliplatin resistance through the Notch/JAK2/STAT3 pathway
表 1 qRT-PCR引物序列
Table 1. Primer sequences for qRT-PCR
基因 序列（5'-3'） GAPDH 上游：CTCACCGGATGCACCAATGTT
下游：CGCGTTGCTCACAATGTTCAT
GINS1 上游：ACGAGGATGGACTCAGACAAG
下游：TGCAGCGTCGATTTCTTAACA
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表 2 shRNA序列
Table 2. shRNA sequence
shRNA 序列（5'-3'） shGINS1-#1 CCGGCAAGTTCTGGAGGAGATGAAACTCGAGTTTCATCTCCTCCAGAACTTGTTTTTT shGINS1-#2 CCGGGAGGAGATGAAAGCTTTGTATCTCGAGATACAAAGCTTTCATCTCCTCTTTT shGINS1-#3 CCGGACCACTGTTCTCTGTTAAGAACTCGAGTTCTTAACAGAACAGTGTCTTTTTT
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