PDF下载 ( 3813 KB)
非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型肝组织T淋巴细胞的特征分析
DOI: 10.12449/JCH250311
Characteristics of T cells in the liver tissues of mice with nonalcoholic steatohepatitis
-
摘要:
目的 采用单细胞测序技术揭示非酒精性脂肪肝炎（NASH）小鼠肝组织T淋巴细胞单细胞水平的异质性和转录组学特征，为研究T淋巴细胞在NASH中的作用机制提供新的依据。 方法 6只C57BL/6雄性小鼠随机分为普通饲料喂养的对照组和胆碱蛋氨酸缺乏饲料喂养的NASH组，每组各3只。造模6周后取小鼠肝组织进行单细胞RNA测序。分析T淋巴细胞单细胞亚群的特异性差异表达基因，分别行降维聚类、细胞类型注释、t分布随机邻域嵌入（t-SNE）、小提琴图、基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。利用免疫荧光染色观察两组小鼠肝脏中Tcrα（T淋巴细胞分子标志）、Tcf7、Cxcr6（特征标志基因）的表达情况。计量资料两组间比较采用成组t检验。 结果 小鼠肝脏中共鉴定出2个T淋巴细胞亚群：（1）第6簇T淋巴细胞占比从对照组的58.5%降低到NASH组的48.7%。前4位特异性基因包括Nsg2、Cd8b1、Cd8a和Tcf7。该簇65%的细胞表达Tcf7（第6簇特征标志基因），定义为Tcf7+T淋巴细胞亚群。GO和KEGG富集分析显示，它们参与调控T淋巴细胞活化、白细胞黏附、结合泛素样蛋白连接酶，以及辅助性T淋巴细胞（Th）17、Th1、Th2细胞分化等信号通路。（2）第7簇T淋巴细胞占比从对照组的41.5%增高到NASH组的51.3%。前4位特异性基因包括Cd40lg、Tcrg-C1、Il2rα和Cxcr6。该簇90%的细胞表达Cxcr6，定义为Cxcr6+T淋巴细胞亚群。GO和KEGG富集分析提示，该亚群参与调控T淋巴细胞活化、细胞因子产生，以及T淋巴细胞受体信号通路、Th17细胞分化与MAPK信号通路。免疫荧光结果显示，与对照组相比，NASH组小鼠肝脏中Tcf7蛋白和Tcrα蛋白共染阳性区域减少（1.80%±0.67% vs 0.33%± 0.13%， P<0.05），而Cxcr6蛋白和Tcrα蛋白共染阳性区域增加（0.50%±0.09% vs 2.66%±0.33%， P<0.001）。 结论 NASH小鼠肝脏中Tcf7+T淋巴细胞的占比降低，而Cxcr6+T淋巴细胞的占比增高，揭示了NASH小鼠肝组织T淋巴细胞的特征和差异。 -
关键词:
- 非酒精性脂肪性肝炎 /
- T淋巴细胞 /
- 单细胞测序 /
- 小鼠， 近交C57BL
Abstract:Objective To investigate the heterogeneity and transcriptomic characteristics of T-cell subsets in the liver of mice with nonalcoholic steatohepatitis （NASH） at the single-cell level using single-cell RNA sequencing （scRNA-seq）， and to provide a reference for studying the mechanism of action of T cells in NASH. Methods Six male C57BL/6 mice were randomly divided into control group fed with regular diet and NASH group fed with methionine-choline-deficient （MCD） diet， with three mice in each group， and liver tissue was collected for scRNA-seq after 6 weeks of modeling. Specific differentially expressed genes were analyzed between T-cell subsets， and related analyses were performed， including dimension clustering， cell type annotation， t-distributed stochastic neighbor embedding （t-SNE）， violin plot， gene ontology （GO） functional enrichment analysis， and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis. Immunofluorescent staining was used to observe the expression of the T cell marker Tcrα and the specific marker genes Tcf7 and Cxcr6 in the liver of mice in the two groups. The independent-samples t test was used for comparison of continuous data between two groups. Results Two T cell subsets were identified in the liver of mice， and the percentage of cluster 6 decreased from 58.5% in the control group to 48.7% in the NASH group. The top four specific genes were Nsg2， Cd8b1， Cd8a， and Tcf7. Tcf7， a characteristic marker gene for cluster 6， was expressed in 65% of cells in cluster 6， and therefore， cluster 6 was defined as Tcf7+ T cells. The GO and KEGG enrichment analyses showed that the differentially expressed genes of cluster 6 were involved in T cell activation， leukocyte adhesion， binding ubiquitin-like protein ligase， and the signaling pathways for Th17， Th1， and Th2 cell differentiation. The percentage of cluster 7 increased from 41.5% in the control group to 51.3% in the NASH group. The top four specific genes of cluster 7 were Cd40lg， Tcrg-C1， Il2rα， and Cxcr6. Cxcr6 was expressed in 90% of cells in cluster 7， and therefore， cluster 7 was defined as Cxcr6+ T cells. The GO and KEGG enrichment analyses showed that cluster 7 was involved in T cell activation， cytokine production， the T cell receptor signaling pathway， and the Th17 cell differentiation and MAPK signaling pathway. Immunofluorescence assay showed that compared with the control group， the NASH group showed a significant reduction in the area with positive co-expression of Tcf7 protein and Tcrα protein （1.80%±0.67% vs 0.33%±0.13%， P<0.05） and a significant increase in the area with positive co-expression of Cxcr6 protein and Tcrα protein （0.50%±0.09% vs 2.66%± 0.33%， P<0.001）. Conclusion There is a reduction in the percentage of Tcf7+ T cells and an increase in the percentage of Cxcr6+ T cells in NASH mice， revealing the characteristics and differences of T cells in the liver of NASH mice. -
非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）进一步进展为肝硬化和肝细胞癌的关键环节。随着肥胖和代谢综合征的流行，NASH和NAFLD已成为全球慢性肝病的最主要病因，严重危害人民生命健康［1］。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种在单细胞水平上对转录组进行扩增和测序的新技术［2］。相比于传统的转录组测序，单细胞RNA测序对了解肝脏非实质细胞，如炎症细胞尤为有效［3］。Su等［4］通过scRNA-seq分析发现了健康和NAFLD小鼠肝脏中非实质细胞的基因表达谱改变。T淋巴细胞是细胞免疫反应的效应细胞。近年来，人们逐渐认识到T淋巴细胞在NAFLD发病过程中的重要作用。Koda等［5］发现，CD69+CD103-CD8+T淋巴细胞在高脂高胆固醇诱导的NASH小鼠肝脏中显著富集。有研究发现，NAFLD患者的外周血中炎症因子IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β1的水平和辅助性T淋巴细胞（Th）17的水平呈正相关［6］，且Th17细胞和IL-17的水平与NASH患者的病情严重程度呈正相关［7］。但在单细胞水平上研究T淋巴细胞在NASH中的特征改变仍是有必要的。因此，本研究采用scRNA-seq技术对健康小鼠和NASH小鼠的肝组织内T淋巴细胞进行分群，旨在揭示NASH小鼠肝组织中不同T淋巴细胞亚群的转录组学特征。
1. 资料与方法
1.1 实验动物
选取8周龄C57BL/6雄性小鼠6只，随机分为对照组和NASH组，每组各3只。对照组喂养普通饲料，NASH组喂养胆碱蛋氨酸缺乏（methionine-choline-deficient， MCD）饲料，造模6周后处死小鼠，取肝组织进行scRNA-seq以获得基因表达谱数据（上海鲸舟基因科技有限公司）［8］。
1.2 研究方法
1.2.1 scRNA-seq
使用Seurat 3.0软件包读取scRNA-seq数据，并为每个数据创建一个Seurat对象。排除独特分子标志<200或>10 000的细胞及线粒体基因含量高于25%的细胞，并根据独特分子标志细胞总计数进行对数标准化后，对前2 000个高可变基因使用主成分分析的降维算法进行降维，随后基于主成分分析降维结果以0.6的分辨率进行聚类。
1.2.2 细胞注释和分簇
使用Seurat 3.0中的FindAllMarkers函数筛选出所有细胞类群中的标志基因，并使用R包Single R 1.4.1内置的小鼠RNA测序数据库作为参考数据集对细胞亚群进行细胞类型注释。通过白细胞分化抗原3α（the cluster of the differentiation 3α，Cd3α）、白细胞分化抗原8α（Cd8α）、白细胞分化抗原4（Cd4）和T淋巴细胞受体α（T cell receptor alpha，Tcrα）来鉴定T淋巴细胞。
1.2.3 特异性差异表达基因（以下简称“特异性基因”）分析
使用Seurat3.0中的FindMarkers函数用于筛选scRNA-seq数据中的差异表达基因，设置log2（FC）>0.25为阈值，并对基因的显著性P值进行检验矫正。随后使用t分布随机邻域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）对数据进行可视化，再通过小提琴图来可视化每个聚类中表达的特异性基因。
1.2.4 功能富集分析
采用Cluster Profiler R软件包对特异性基因集进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO数据库是从生物学过程、细胞组分、分子功能3个方面对基因和基因产物进行分类注释。
1.2.5 免疫荧光染色
分别将对照组小鼠和NASH组小鼠肝脏切片进行烤片、脱蜡、水化、抗原修复和血清封闭后，加入以下一抗：Tcrα（Abcam公司，货号：ab288432）、Tcf7（Abcam公司，货号：ab315392）和Cxcr6（Boster公司，货号：BA3082），并置于4 ℃冰箱中孵育过夜。次日滴加Alexa 488（Yeasen公司，货号：34106ES60）、Alexa 594（Yeasen公司，货号：33112ES60）标记的荧光二抗和DAPI染液后封片。抗体稀释倍数均为1∶200。使用荧光显微镜拍照观察，并用Image J1.8.0软件进行荧光面积占比测定。
1.3 统计学方法
使用SPSS 19.0、Graphpad prism 10和Image J软件对荧光免疫结果进行统计分析和可视化处理。计量资料采用
2. 结果
2.1 NASH小鼠肝组织T淋巴细胞亚群的分群和各亚群的变化
从NASH组小鼠和对照组小鼠的肝脏中分离出单细胞，得到来自对照组的4 336个细胞和来自NASH组的3 893个细胞［8］。通过分析所有细胞中表达不同的基因，共鉴定出21个细胞簇。其中，第6、7簇被鉴定为T淋巴细胞（图1a）。比较两组T淋巴细胞亚群的占比情况发现，第6簇T淋巴细胞的比例从对照组的58.5%降低到NASH组的48.7%，而第7簇T淋巴细胞则从对照组的41.5%增高到NASH组的51.3%（图1b）。热图显示了第6、7簇T淋巴细胞前10位特异性基因（图1c）。
注： a，小鼠肝组织中T淋巴细胞亚群的t-SNE分析，其中左图显示21个细胞簇（绿色的2簇为T淋巴细胞簇），右图显示第6、7簇T淋巴细胞簇；b，第6、7簇T淋巴细胞在对照组和NASH组中的占比；c，热图显示第6、7簇T淋巴细胞前10位特异性基因。图 1 NASH组小鼠肝组织T淋巴细胞亚群的分群和各亚群的变化Figure 1. Definition of T cell subsets and changes in each subpopulation in the liver tissues of NASH mice2.2 第6簇T淋巴细胞的转录组学特征
为进一步研究第6簇T淋巴细胞的转录组学特征，通过t-SNE分析显示，第6簇T淋巴细胞的前10位特异性基因，包括神经元特异性基因2（neuron-specific gene 2，Nsg2）、白细胞分化抗原8b1（the cluster of the differentiation 8 subunit beta 1，Cd8b1）、Cd8a、转录因子7（transcription factor 7，Tcf7）（图2a）和其他6个特异性基因（表1）。通过小提琴图显示第6簇前4位特异性基因（图2b）。表1显示，65%的第6簇T淋巴细胞表达Tcf7（pct_FC排名第4，但pct_FC前三的基因在第6簇T淋巴细胞中的表达率均低于50%）。因此Tcf7作为第6簇T淋巴细胞的特征标志基因，定义为Tcf7+T淋巴细胞亚群。KEGG途径富集分析显示，第6簇T淋巴细胞参与T淋巴细胞受体、Th17细胞分化和Th1、Th2细胞分化等多个炎症相关信号通路的调控（图2c）。GO富集分析结果显示，第6簇T淋巴细胞特异表达基因主要参与活化T淋巴细胞、白细胞细胞间黏附、磷酸化的负调控的生物学过程，核糖体、肌动蛋白细胞骨架、细胞质的细胞组分，以及结合mRNA、结合泛素样蛋白连接酶、结合鸟苷酸的分子功能（图2d）。
注： t-SNE图（a）和小提琴图（b）显示第6簇T淋巴细胞的前4位特异性基因；第6簇T淋巴细胞的特异性基因的KEGG通路富集分析（c）和GO富集分析（d）。图 2 第6簇T淋巴细胞的转录组学特征Figure 2. The transcriptomic characteristics of Cluster 6表 1 第6簇T细胞前10位特异性基因Table 1. Top10 specific DEGs of Cluster 6基因 P值 avg_logFC pct.1 pct.2 校正后的P值 pct_FC Nsg2 5×10-324 0.77 0.25 0.001 5×10-324 253.99 Cd8b1 5×10-324 1.89 0.49 0.012 5×10-324 40.42 Cd8a 5×10-324 1.67 0.44 0.014 5×10-324 31.36 Tcf7 5×10-324 1.95 0.65 0.027 5×10-324 24.22 Sidt1 1.63×10-303 0.92 0.31 0.013 3.89×10-299 24.15 Cd5 4.64×10-292 1.06 0.32 0.016 1.11×10-287 19.99 Lef1 5×10-324 1.24 0.42 0.025 5×10-324 16.64 Themis 3.21×10-241 0.84 0.30 0.018 7.66×10-237 16.44 Cd247 1.03×10-282 0.91 0.35 0.022 2.44×10-278 15.99 Bcl11b 5×10-324 1.57 0.60 0.039 5×10-324 15.44 注：avg_logFC，平均对数倍数变化； pct.1，在第6簇的表达百分比；pct.2，在其他细胞簇的表达百分比； pct-FC，百分比倍数变化。
2.3 第7簇T淋巴细胞的转录组学特征
t-SNE分析发现，第7簇T淋巴细胞特异性表达白细胞分化抗原40配体基因（Cd40lg）、γ链T细胞受体抗原1（T-cell receptors gamma-chain 1， Tcrg-C1）、白细胞介素2受体α（interleukin-2 receptor α，Il2rα）、CXC趋化因子受体6（C-X-C motif chemokine receptor 6，Cxcr6）（图3a）和其他6个基因（表2）。通过小提琴图显示出第7簇前4位特异性基因（图3b）。表2显示，在第7簇中，90%的T淋巴细胞表达Cxcr6（pct_FC排名第4，且pct_FC排名前3位的基因在第7簇T淋巴细胞中表达率均低于50%）。因此Cxcr6是第7簇T淋巴细胞的特征标志基因，定义为Cxcr6+T淋巴细胞亚群。KEGG途径富集分析显示，第7簇显著富集的通路包括T淋巴细胞受体信号通路、Th17细胞分化和MAPK信号通路（图3c）。GO富集分析显示，第7簇的特异性基因主要参与T淋巴细胞活化、免疫效应过程的调控、细胞因子产生的生物学过程，细胞质、核糖体、神经元间突触的细胞组分，以及结合嘌呤核糖核苷、结合GTP、泛素样蛋白连接酶的分子功能（图3d）。
注： t-SNE图（a）和小提琴图（b）显示第7簇T淋巴细胞的前4位特异性基因；第7簇T淋巴细胞的特异性基因的GO富集分析（c）和KEGG通路富集分析（d）。图 3 第7簇T细胞的转录组学特征Figure 3. The transcriptomic characteristics of Cluster 7表 2 第7簇T淋巴细胞前10位特异性基因Table 2. Top10 specific DEGs of Cluster 7基因 P值 avg_logFC pct.1 pct.2 校正后的P值 pct_FC Cd40lg 7.69×10-294 0.73 0.26 0.006 1.83×10-289 42.50 Tcrg-C1 5×10-324 1.56 0.46 0.013 5×10-324 35.00 Il2ra 5×10-324 0.99 0.34 0.011 5×10-324 31.00 Cxcr6 5×10-324 2.32 0.90 0.04 5×10-324 22.50 Klrb1c 5×10-324 1.53 0.58 0.03 5×10-324 19.47 Tcrg-C2 5×10-324 1.48 0.44 0.023 5×10-324 19.04 Prrt1 3.39×10-258 0.87 0.32 0.017 8.09×10-254 18.76 Tcrg-C4 7.30×10-290 1.16 0.37 0.02 1.74×10-285 18.50 Il12rb2 9.05×10-193 0.64 0.25 0.014 2.16×10-188 17.93 Cd160 5×10-324 1.12 0.45 0.025 5×10-324 17.80 注：pct.1，在第7簇的表达百分比；pct.2，在其他细胞簇的表达百分比。
2.4 免疫荧光验证NASH小鼠肝组织中两种T淋巴细胞的变化
免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，NASH组小鼠肝组织Tcf7蛋白和Tcrα蛋白共染阳性区域显著减少（1.80%±0.67% vs 0.33%±0.13%， P<0.05）（图4a、b）；而Cxcr6蛋白和Tcrα蛋白共染阳性区域显著增加（0.50%±0.09% vs 2.66%±0.33%， P<0.001）（图4c、d）。以上免疫荧光结果均与单细胞测序的分析趋势一致。
注： DAPI蓝色荧光代表细胞核，Tcrα蛋白红色荧光代表T淋巴细胞。a，绿色荧光为Tcf7，黄色箭头指Tcf7+Tcrα+T淋巴细胞（×630）；b，Tcf7+Tcrα+T淋巴细胞占比；c，绿色荧光为Cxcr6，黄色箭头指Cxcr6+Tcrα+T淋巴细胞（×630）；d，Cxcr6+Tcrα+T淋巴细胞占比。图 4 免疫荧光显示T淋巴细胞亚群及特征标志基因的变化Figure 4. Immunofluorescence shows the changes of T cell subsets and of the expression of the most specific genes between the control and NASH group3. 讨论
NASH是NAFLD病情进展的关键阶段，以5%以上的肝细胞脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变为特征［9］，是一种影响了全球约1/4人口的慢性肝脏疾病，可发展为肝硬化和肝癌［10-11］，是当前研究热点之一。但NASH发病机制尚不完全清楚［12］。
T淋巴细胞作为适应型免疫的重要组成成分，占肝脏内淋巴细胞的50%以上。根据识别抗原提呈细胞上不同类型的主要组织相容性复合物，T淋巴细胞可以被划分为CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞［13］。Wolf等［14］发现，在MCD饮食喂养的小鼠肝脏中，CD8+T淋巴细胞数量增高且活性增强，并引发由该种饮食所诱导的肝损伤，但不会影响肝内脂质代谢。Her等［15］发现CD4+T淋巴细胞可能通过释放促炎因子IL-17A和干扰素γ促进NAFLD有关的炎症和脂肪变性向纤维化转变过程。
相比于传统细胞测序方法，单细胞测序不仅使获得的遗传信息更加精确，还能检测微量的基因表达水平［16］。近年来，单细胞测序技术的应用促进了人们对慢性肝脏疾病中T淋巴细胞亚群复杂异质性的了解。Li等［17］发现，与健康人群的肝脏相比，NAFLD患者肝脏内的CD4+T淋巴细胞数目增多，并发现了CD4+T淋巴细胞内4个差异表达基因（MIGI3、RCAN3、DOCK10和SAMD12）与NAFLD有关。Huang等［18］发现，在NAFLD斑马鱼肝脏内，CD8+T淋巴细胞可分为6个亚群（CD8-gzmk、CD8-rorc、CD8-ccl38.6、CD8-lta、CD8-mki67和CD8-mcm4），而CD4+T淋巴细胞可分为4个亚群（CD4-foxp3a、CD4-cd28、CD4-cebpb和CD4-mki67）。
本研究通过对健康小鼠和MCD诱导的NASH小鼠的肝脏进行单细胞测序，重点研究筛选出的2个T淋巴细胞亚群：（1）第6簇T淋巴细胞在NASH小鼠肝脏中的占比从对照组的58.5%降低到NASH组的48.7%。65%的该簇T淋巴细胞表达Tcf7，因而作为该簇的标志基因。功能富集分析发现，该T淋巴细胞亚群主要发挥活化T淋巴细胞、白细胞细胞间黏附、结合泛素样蛋白连接酶等作用，并参与调控Th17、Th1、Th2细胞分化等多个炎症相关信号通路。免疫荧光染色结果证实，NASH组小鼠肝组织中Tcf7+T淋巴细胞较对照组减少。Tcf7基因编码产生T淋巴细胞因子1（T cell factor-1，TCF1），并参与Wnt/β连环蛋白信号通路，在分化T淋巴细胞方面发挥重要作用。Yu等［19］发现，在Wnt/β连环蛋白信号通路的调节下，TCF1通过诱导Gata结合蛋白3的产生促进Th2的分化。Th2细胞主要分泌细胞因子IL-4/5/6/10等，主要发挥抗炎作用［20］。过度表达的TCF1可以促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，并抑制凋亡［21］。Gui等［22］发现，与原发性肝癌和正常肝组织相比，Tcf7+CD8+记忆T淋巴细胞特异性富集于转移性肝癌中。（2）此外，还发现第7簇T淋巴细胞的比例从对照组的41.5%增高到NASH组的51.3%。90%的该簇T淋巴细胞表达Cxcr6基因（作为标志基因）。GO富集分析提示，第7簇的特异性基因主要发挥T淋巴细胞活化和产生细胞因子的功能。KEGG通路富集分析发现，第7簇T淋巴细胞显著富集的通路包括T淋巴细胞受体信号通路、Th17细胞分化和MAPK信号通路。同时，免疫荧光结果显示，与对照组相比，NASH组小鼠肝组织中Cxcr6+T淋巴细胞增加。Cxcr6最初被发现表达于人类记忆T淋巴细胞［23］，表达Cxcr6基因的CD8+T淋巴细胞可依赖IL-15促进肝细胞凋亡［24］，激活Cxcr6通路可促进肝内自然杀伤T淋巴细胞聚集，进而加重肝内炎症反应并促进肝纤维化［25］。但Tcf7+T淋巴细胞和Cxcr6+T淋巴细胞在NASH中的具体机制尚未有研究报道，有待进一步地深入研究。
综上所述，通过NASH小鼠肝脏的单细胞测序，在NASH中筛选出2个肝组织T淋巴细胞亚群：Tcf7+T淋巴细胞的占比降低，推测其可能通过促进Th2细胞的分化发挥抗炎作用；而Cxcr6+T淋巴细胞的占比增高，推测其可能通过MAPK信号通路发挥促炎作用。
-
注： a，小鼠肝组织中T淋巴细胞亚群的t-SNE分析，其中左图显示21个细胞簇（绿色的2簇为T淋巴细胞簇），右图显示第6、7簇T淋巴细胞簇；b，第6、7簇T淋巴细胞在对照组和NASH组中的占比；c，热图显示第6、7簇T淋巴细胞前10位特异性基因。
图 1 NASH组小鼠肝组织T淋巴细胞亚群的分群和各亚群的变化
Figure 1. Definition of T cell subsets and changes in each subpopulation in the liver tissues of NASH mice
注： t-SNE图（a）和小提琴图（b）显示第6簇T淋巴细胞的前4位特异性基因；第6簇T淋巴细胞的特异性基因的KEGG通路富集分析（c）和GO富集分析（d）。
图 2 第6簇T淋巴细胞的转录组学特征
Figure 2. The transcriptomic characteristics of Cluster 6
注： t-SNE图（a）和小提琴图（b）显示第7簇T淋巴细胞的前4位特异性基因；第7簇T淋巴细胞的特异性基因的GO富集分析（c）和KEGG通路富集分析（d）。
图 3 第7簇T细胞的转录组学特征
Figure 3. The transcriptomic characteristics of Cluster 7
注： DAPI蓝色荧光代表细胞核，Tcrα蛋白红色荧光代表T淋巴细胞。a，绿色荧光为Tcf7，黄色箭头指Tcf7+Tcrα+T淋巴细胞（×630）；b，Tcf7+Tcrα+T淋巴细胞占比；c，绿色荧光为Cxcr6，黄色箭头指Cxcr6+Tcrα+T淋巴细胞（×630）；d，Cxcr6+Tcrα+T淋巴细胞占比。
图 4 免疫荧光显示T淋巴细胞亚群及特征标志基因的变化
Figure 4. Immunofluorescence shows the changes of T cell subsets and of the expression of the most specific genes between the control and NASH group
表 1 第6簇T细胞前10位特异性基因
Table 1. Top10 specific DEGs of Cluster 6
基因 P值 avg_logFC pct.1 pct.2 校正后的P值 pct_FC Nsg2 5×10-324 0.77 0.25 0.001 5×10-324 253.99 Cd8b1 5×10-324 1.89 0.49 0.012 5×10-324 40.42 Cd8a 5×10-324 1.67 0.44 0.014 5×10-324 31.36 Tcf7 5×10-324 1.95 0.65 0.027 5×10-324 24.22 Sidt1 1.63×10-303 0.92 0.31 0.013 3.89×10-299 24.15 Cd5 4.64×10-292 1.06 0.32 0.016 1.11×10-287 19.99 Lef1 5×10-324 1.24 0.42 0.025 5×10-324 16.64 Themis 3.21×10-241 0.84 0.30 0.018 7.66×10-237 16.44 Cd247 1.03×10-282 0.91 0.35 0.022 2.44×10-278 15.99 Bcl11b 5×10-324 1.57 0.60 0.039 5×10-324 15.44 注：avg_logFC，平均对数倍数变化； pct.1，在第6簇的表达百分比；pct.2，在其他细胞簇的表达百分比； pct-FC，百分比倍数变化。
下载: 导出CSV
表 2 第7簇T淋巴细胞前10位特异性基因
Table 2. Top10 specific DEGs of Cluster 7
基因 P值 avg_logFC pct.1 pct.2 校正后的P值 pct_FC Cd40lg 7.69×10-294 0.73 0.26 0.006 1.83×10-289 42.50 Tcrg-C1 5×10-324 1.56 0.46 0.013 5×10-324 35.00 Il2ra 5×10-324 0.99 0.34 0.011 5×10-324 31.00 Cxcr6 5×10-324 2.32 0.90 0.04 5×10-324 22.50 Klrb1c 5×10-324 1.53 0.58 0.03 5×10-324 19.47 Tcrg-C2 5×10-324 1.48 0.44 0.023 5×10-324 19.04 Prrt1 3.39×10-258 0.87 0.32 0.017 8.09×10-254 18.76 Tcrg-C4 7.30×10-290 1.16 0.37 0.02 1.74×10-285 18.50 Il12rb2 9.05×10-193 0.64 0.25 0.014 2.16×10-188 17.93 Cd160 5×10-324 1.12 0.45 0.025 5×10-324 17.80 注：pct.1，在第7簇的表达百分比；pct.2，在其他细胞簇的表达百分比。
下载: 导出CSV
-
[1] YOUNOSSI ZM, KOENIG AB, ABDELATIF D, et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes[J]. Hepatology, 2016, 64( 1): 73- 84. DOI: 10.1002/hep.28431. [2] LI J, LI YN, YANG JB, et al. Application of single cell sequencing technology in liver regeneration[J]. Chin J Dig Surg, 2023, 22( 5): 663- 666. DOI: 10.3760/cma.j.cn115610-20230316-00109.李鉴, 李勇男, 杨建宝, 等. 单细胞测序技术在肝再生中的应用[J]. 中华消化外科杂志, 2023, 22( 5): 663- 666. DOI: 10.3760/cma.j.cn115610-20230316-00109. [3] HUNDERTMARK J, BERGER H, TACKE F. Single cell RNA sequencing in NASH[J]. Methods Mol Biol, 2022, 2455: 181- 202. DOI: 10.1007/978-1-0716-2128-8_15. [4] SU Q, KIM SY, ADEWALE F, et al. Single-cell RNA transcriptome landscape of hepatocytes and non-parenchymal cells in healthy and NAFLD mouse liver[J]. iScience, 2021, 24( 11): 103233. DOI: 10.1016/j.isci.2021.103233. [5] KODA Y, TERATANI T, CHU PS, et al. CD8+ tissue-resident memory T cells promote liver fibrosis resolution by inducing apoptosis of hepatic stellate cells[J]. Nat Commun, 2021, 12( 1): 4474. DOI: 10.1038/s41467-021-24734-0. [6] LI WG, ZHOU YW, ZHANG XZ. Level and correlation of peripheral blood hypoxia-inducible factor-1α, regulatory T cell and helper T cell and inflammatory cytokines in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J/CD]. Chin J Liver Dis Electron Version, 2020, 12( 4): 83- 88. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7380.2020.04.015.李文刚, 周运王, 张学政. 非酒精性脂肪性肝病患者外周血缺氧诱导因子-1α、调节性T细胞和辅助性T细胞17与炎性细胞因子水平及其相关性[J/CD]. 中国肝脏病杂志(电子版), 2020, 12( 4): 83- 88. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7380.2020.04.015. [7] LI Y, DU ZX, WANG MT, et al. Correlation between disease progression and levels of T cells in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Clin Med Pract, 2020, 24( 14): 11- 14, 18. DOI: 10.7619/jcmp.202014003.李阳, 杜志祥, 王牧婷, 等. 非酒精性脂肪性肝病患者病情进展与T细胞水平的相关性研究[J]. 实用临床医药杂志, 2020, 24( 14): 11- 14, 18. DOI: 10.7619/jcmp.202014003. [8] LI HY, GAO YX, WU JC, et al. Single-cell transcriptome reveals a novel mechanism of C-Kit+-liver sinusoidal endothelial cells in NASH[J]. Cell Biosci, 2024, 14( 1): 31. DOI: 10.1186/s13578-024-01215-7. [9] National Workshop on Fatty Liver and Alcoholic Liver Disease, Chinese Society of Hepatology, Chinese Medical Association, Fatty Liver Expert Committee, Chinese Medical Doctor Association. Guidelines of prevention and treatment for nonalcoholic fatty liver disease: A 2018 update[J]. J Clin Hepatol, 2018, 34( 5): 947- 957. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2018.05.007.中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组, 中国医师协会脂肪性肝病专家委员会. 非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)[J]. 临床肝胆病杂志, 2018, 34( 5): 947- 957. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2018.05.007. [10] YOUNOSSI Z, TACKE F, ARRESE M, et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis[J]. Hepatology, 2019, 69( 6): 2672- 2682. DOI: 10.1002/hep.30251. [11] ZHANG SL, CAO MM, YANG F, et al. Analysis of the change trend of etiological burden of disease of liver cancer in the Chinese population from 1990 to 2019[J]. Chin J Dig Surg, 2023, 22( 1): 122- 130. DOI: 10.3760/cma.j.cn115610-20221112-00687.张绍丽, 曹毛毛, 杨帆, 等. 1990—2019年中国人群肝癌各病因疾病负担变化趋势分析[J]. 中华消化外科杂志, 2023, 22( 1): 122- 130. DOI: 10.3760/cma.j.cn115610-20221112-00687. [12] HARDY T, OAKLEY F, ANSTEE QM, et al. Nonalcoholic fatty liver disease: Pathogenesis and disease spectrum[J]. Annu Rev Pathol, 2016, 11: 451- 496. DOI: 10.1146/annurev-pathol-012615-044224. [13] NOUREDDIN M, SANYAL AJ. Pathogenesis of NASH: The impact of multiple pathways[J]. Curr Hepatol Rep, 2018, 17( 4): 350- 360. DOI: 10.1007/s11901-018-0425-7. [14] WOLF MJ, ADILI A, PIOTROWITZ K, et al. Metabolic activation of intrahepatic CD8+ T cells and NKT cells causes nonalcoholic steatohepatitis and liver cancer via cross-talk with hepatocytes[J]. Cancer Cell, 2014, 26( 4): 549- 564. DOI: 10.1016/j.ccell.2014.09.003. [15] HER Z, TAN JHL, LIM YS, et al. CD4+ T cells mediate the development of liver fibrosis in high fat diet-induced NAFLD in humanized mice[J]. Front Immunol, 2020, 11: 580968. DOI: 10.3389/fimmu.2020.580968. [16] ZHANG YZ, FU BQ, NIU CY, et al. The development of single cell sequencing[J]. Acta Metrol Sin, 2023, 44( 1): 149- 156. DOI: 10.3969/j.issn.1000-1158.2023.01.22.张永卓, 傅博强, 牛春艳, 等. 单细胞测序技术的发展[J]. 计量学报, 2023, 44( 1): 149- 156. DOI: 10.3969/j.issn.1000-1158.2023.01.22. [17] LI DR, ZHANG ZJ, ZHANG C, et al. Unraveling the connection between Hashimoto’s Thyroiditis and non-alcoholic fatty liver disease: Exploring the role of CD4+ central memory T cells through integrated genetic approaches[J]. Endocrine, 2024, 85( 2): 751- 765. DOI: 10.1007/s12020-024-03745-z. [18] HUANG YY, LIU X, WANG HY, et al. Single-cell transcriptome landscape of zebrafish liver reveals hepatocytes and immune cell interactions in understanding nonalcoholic fatty liver disease[J]. Fish Shellfish Immunol, 2024, 146: 109428. DOI: 10.1016/j.fsi.2024.109428. [19] YU Q, SHARMA A, OH SY, et al. T cell factor 1 initiates the T helper type 2 fate by inducing the transcription factor GATA-3 and repressing interferon-gamma[J]. Nat Immunol, 2009, 10( 9): 992- 999. DOI: 10.1038/ni.1762. [20] ROLLA S, ALCHERA E, IMARISIO C, et al. The balance between IL-17 and IL-22 produced by liver-infiltrating T-helper cells critically controls NASH development in mice[J]. Clin Sci(Lond), 2016, 130( 3): 193- 203. DOI: 10.1042/CS20150405. [21] WANG ZY. Review on the mechanism of T-cell factor 3 in the progression and metastasis of hepatocellular carcinoma[J]. J World Latest Med Inf, 2024, 24( 16): 43- 46. DOI: 10.3969/j.issn.1671-3141.2024.016.009.王梓伊. T细胞因子3促进肝癌侵袭和转移的机制的综述[J]. 世界最新医学信息文摘, 2024, 24( 16): 43- 46. DOI: 10.3969/j.issn.1671-3141.2024.016.009. [22] GUI MH, HUANG SL, LI SZ, et al. Integrative single-cell transcriptomic analyses reveal the cellular ontological and functional heterogeneities of primary and metastatic liver tumors[J]. J Transl Med, 2024, 22( 1): 206. DOI: 10.1186/s12967-024-04947-9. [23] UNUTMAZ D, XIANG W, SUNSHINE MJ, et al. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse[J]. J Immunol, 2000, 165( 6): 3284- 3292. DOI: 10.4049/jimmunol.165.6.3284. [24] DUDEK M, PFISTER D, DONAKONDA S, et al. Auto-aggressive CXCR6+ CD8 T cells cause liver immune pathology in NASH[J]. Nature, 2021, 592( 7854): 444- 449. DOI: 10.1038/s41586-021-03233-8. [25] WEHR A, BAECK C, HEYMANN F, et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis[J]. J Immunol, 2013, 190( 10): 5226- 5236. DOI: 10.4049/jimmunol.1202909. -
下载:
本文二维码
计量
- 文章访问数: 64
- HTML全文浏览量: 32
- PDF下载量: 9
- 被引次数: 0
