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下瘀血汤对非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肾损伤的干预作用及其机制
DOI: 10.12449/JCH241114
Effect of Xiayuxue Decoction against renal injury in mice with non-alcoholic fatty liver disease and its mechanism
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摘要:
目的 探讨高脂饮食（HFD）诱导非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）对小鼠肾脏的影响，以及下瘀血汤对NAFLD小鼠模型的保护作用及其机制。 方法 选取2020年9月—2021年9月在上海中医药大学附属普陀医院健康对照及NAFLD患者各25例，检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）及尿酸（UA）水平；将24只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组（LFD组）、高脂组（HFD组）及高脂+下瘀血汤组（XYXD组），每组8只，第13周开始给予下瘀血汤每日1次灌胃至18周末，维持6周。检测各组TC、TG、BUN及Cr水平。HE、油红O染色观察肝脏和肾脏病理变化，免疫组化双染技术检测CD68和α-SMA表达。实时荧光定量PCR检测肾组织固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）、脂肪酸合酶（FASN）、IL-6、TNF-α、结蛋白（Desmin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的mRNA表达。Western Blot检测SREBP1和TNF-α蛋白水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用成组t检验。 结果 与健康对照组患者相比，NAFLD患者TC、TG、BUN、Cr、UA水平均升高（P值均<0.05）。与LFD组小鼠相比，HFD组小鼠体质量、TC、TG、BUN、Cr水平均升高（P值均<0.001）；与HFD组相比，XYXD显著抑制NAFLD小鼠TC、TG、BUN、CR表达（P值均<0.001）。肝脏病理学显示：HFD组小鼠肝脂肪变及炎症浸润较LFD组显著增加，而XYXD组病变显著减轻。肾脏病理学显示：与LFD组相比，HFD组肾组织炎性浸润明显，脂肪变显著，肾脏胶原形成明显；与HFD组相比，XYXD显著减轻炎症浸润、抑制脂肪变及肾脏胶原形成。实时荧光定量PCR结果显示：与LFD组相比，HFD组肾组织中SREBP1、FASN、IL-6、TNF-α、Desmin和α-SMA的mRNA相对表达水平均显著升高（P值均<0.001），XYXD组较HFD组均显著降低（P值均<0.001）。Western Blot结果显示：与LFD组比较，HFD组SREBP1及TNF-α蛋白表达水平均明显上调（P值均<0.05）；与HFD组比较，XYXD组SREBP1及TNF-α蛋白表达水平均明显下调（P值均<0.05）。免疫组化染色结果显示：HFD组α-SMA和CD68阳性染色及双阳性染色较LFD组均显著升高（P值均<0.05），XYXD组较HFD组均显著下降（P值均<0.05）。 结论 HFD可诱导肾脏脂肪变、炎症浸润及胶原形成，下瘀血汤可能通过抑制肾组织巨噬细胞与肌成纤维细胞表达发挥肾脏保护作用。 -
关键词:
- 非酒精性脂肪性肝病 /
- 膳食， 高脂 /
- 肾损伤 /
- 下瘀血汤 /
- 小鼠， 近交C57BL
Abstract:Objective To investigate the effect of non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） induced by high-fat diet （HFD） on the kidneys of mice and the protective effect and mechanism of Xiayuxue Decoction. Methods A total of 25 healthy controls and 25 NAFLD patients who attended Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine from September 2020 to September 2021 were enrolled， and the levels of total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， blood urea nitrogen （BUN）， creatinine （Cr）， and uric acid （UA） were measured. A total of 24 male C57BL/6 mice were randomly divided into low-fat diet （LFD） group， HFD group， and HFD+Xiayuxue Decoction group （XYXD group）， with 8 mice in each group， and since week 13， XYXD was administered by gavage once a day for 6 weeks till the end of week 18. The level of TC， TG， BUN， and Cr were measured for each group. HE staining and oil red staining were used to observe the pathological changes of the liver and the kidneys； immunohistochemical double staining was used to measure the expression levels of CD68 and alpha-smooth muscle actin （α-SMA）； quantitative real-time PCR was used to measure the expression levels of sterol regulatory element binding protein 1 （SREBP1）， fatty acid synthase （FASN）， interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， Desmin， and α-SMA in renal tissue； Western blot was used to measure the protein expression levels of SREBP1 and TNF-α. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for pairwise comparison； the independent-samples t-test was used for comparison between two groups. Results Compared with the healthy controls， NAFLD patients showed significant increases in the levels of TC， TG， BUN， Cr， and UA （all P<0.05）. Compared with the LFD group， the HFD group had significant increases in body weight， TC， TG， BUN， and Cr （all P<0.001）， and compared with the HFD group， the XYXD group showed significant inhibition of the expression of TC， TG， BUN， and Cr （all P<0.001）. Liver pathological examination showed that compared with the LFD group， the HFD group showed significant increases in hepatic steatosis and inflammatory infiltration， while the XYXD group showed significant alleviation of lesions. Renal pathological examination showed that compared with the LFD group， the HFD group had significant inflammatory infiltration， steatosis， and collagen formation in renal tissue， and compared with the HFD group， XYXD significantly alleviated inflammatory infiltration and inhibited steatosis and collagen formation. Quantitative real-time PCR showed that compared with the LFD group， the HFD group had significant increases in the relative mRNA expression levels of SREBP1， FASN， IL-6， TNF-α， Desmin， and α-SMA in renal tissue （all P<0.001）， and compared with the HFD group， the XYXD group had significant reductions in the relative expression levels of these indicators （all P<0.001）. Western blot showed that compared with the LFD group， the HFD group had significant increases in the protein expression levels of SREBP1 and TNF-α （P<0.05）， and compared with the HFD group， the XYXD group had significant reductions in the protein expression levels of SREBP1 and TNF-α （P<0.05）. Immunohistochemical staining showed that compared with the LFD group， the HFD group had significant increases in the positive staining or the double positive staining of α- SMA and CD68 （P<0.05）， and compared with the HFD group， the XYXD group showed significant reductions （P<0.05）. Conclusion HFD can induce renal steatosis， inflammatory infiltration， and collagen formation， and XYXD might exert a protective effect on the kidneys by inhibiting the expression of macrophages and myofibroblasts in renal tissue. -
高脂肪、高糖食物摄入将导致血脂代谢紊乱［1-2］、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生，增加慢性肾病和心血管等疾病发生风险，肾损伤加重而致的肾功能衰竭严重危害人类健康。目前，针对NAFLD进展过程中肾脏病理病变研究相对较少［3-4］。
下瘀血汤出自东汉张仲景的《金匮要略》，被广泛用于治疗产后腹痛、慢性肝病、肝硬化、非酒精性脂肪肝等疾病［5-8］。20世纪50～60年代，已故上海名医姜春华教授首先使用下瘀血汤治疗血吸虫性肝硬化和肝纤维化，此后历经中医肝病研究几代人的传承，下瘀血汤已成为治疗瘀血阻络型疾病的经典方剂。NAFLD的临床用药大数据文献分析显示：活血化瘀类中药为使用最广泛的药物，因此，下瘀血汤临床治疗NAFLD具有理论基础。本课题组前期发现下瘀血汤可改善胆碱蛋氨酸缺乏（methionine and choline deficient，MCD）小鼠模型的脂肪变及高脂饮食（HFD）诱导的NAFLD形成［9-11］，但对肾脏的影响尚未涉及，故本研究将通过NAFLD患者和HFD诱导的NAFLD小鼠模型，探讨NAFLD对肾脏的影响，以及下瘀血汤的干预作用及机制。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
收集2020年9月—2021年9月在上海中医药大学附属普陀医院体检患者的病历资料，年龄18～70岁，分析年龄、性别、血脂及肾功能，其中健康对照受试25例（对照组），NAFLD患者25例（NAFLD组）。诊断均符合《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2018年更新版）》中对NAFLD的诊断标准［12］，均经腹部B超和/或腹部CT等检查确诊。纳入标准：（1）年龄18～70岁，性别不限；（2）既往未接受保肝降脂等治疗；（3）每周饮酒量<100 g；（4）视听、沟通能力正常，配合度良好；（5）肾、肝等重大脏器功能无异常。排除标准：（1）合并病毒性肝炎等其他肝病者；（2）明确为肝豆状核变性、妊娠、药物NAFLD者；（3）合并免疫缺陷性疾病或存在凝血功能障碍者；（4）同期参与其他研究者；（5）合并其他影响糖脂代谢疾病者；（6）合并全身严重感染性疾病者；（7）合并恶性肿瘤者、血液系统疾病、心脑卒中、内分泌系统疾病；（8）存在药物依赖史、吸毒史、酒精成瘾史者；（9）入组时服用影响肝肾功能药物者。
1.2 动物及造模
6～8周龄雄性C57BL/6小鼠，购自上海斯莱克实验动物公司，动物生产许可证号：SYXK（沪）2019-0006，饲养于上海中医药大学附属普陀医院实验动物中心，使用许可证号：SYXK（沪）2019-0019。24只雄性C57BL/6小鼠按照随机数法分为对照组（LFD组）、高脂组（HFD组）及高脂加下瘀血汤组（XYXD组，0.4678 g/kg，相当于75 kg成人体质量的10倍量），每组8只，高脂饮食第13周开始给予下瘀血汤每日1次灌胃6周至18周末。下瘀血汤所含的大黄（掌叶大黄，青海）、桃仁（山西）、虫（江苏）均购自上海华宇药业，由上海中医药大学附属曙光医院制备。具体制备方法：大黄2.0 kg、桃仁2.0 kg和虫1.2 kg，各自制成粗粉，分别加入8倍量20%乙醇浸泡1 h后混合；回流提取2次，先加20%乙醇回流提取30 min，过滤收药汁；药渣再加6倍量20%乙醇回流提取1 h，过滤收药汁。合并两次所收药汁，真空干燥称重为0.585 kg，每克所含生药量为 8.889 g，临用前配制成浓度为0.63 g/mL的下瘀血汤药液。
1.3 生化检测
血脂代谢及肾功能检测采用中国南京建成有限公司试剂盒（货号：A110-2-1、A111-2-1、C013-2-1、C011-2-1）。
1.4 肾组织病理染色
选取肾组织，10%中性福尔马林固定，自动脱水机逐级脱水，包埋、4 μm切片。Leica全自动染色机进行HE染色，观察组织学形态，由本院病理科2位医师盲法阅片评估NAS评分。
1.5 免疫组织双染
免疫组化双染采用德国Vector公司双染试剂盒（货号：MP-7714），方法按照说明书操作，但稍作调整［13］：常规脱蜡至水，Tris-EDTA抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，一抗α-SMA（英国Abcam，货号124964），4 ℃孵育过夜，滴加二抗（德国Vector，货号BA1000），滴加A+B（德国Vector，货号PK-6100），DAB显色（中杉金桥，货号ZLI-9018），PBS洗；滴加一抗CD68（中杉金桥，货号ZM-0060），4 ℃孵育过夜，PBS清洗，滴加德国Vector双染试剂盒中二抗，37 ℃孵育1 h，PBS清洗，AP（蓝色）显色液显色，水洗后苏木素复染，充分水洗，无水乙醇脱水，二甲苯透明，封片。日本Olympus显微镜和DP72拍照系统，观察，读片，拍照。采用Image-pro plus 6.0软件统计并分析图片中阳性面积。
1.6 油红O染色
采用冰冻切片机对冰冻组织切片，利用油红对冰冻切片进行染色，油红-O与dd-H2O按3∶2配比稀释，60%异丙醇清洗，油红O染色15 min，晾干，纯水清洗，苏木素染核15 s，甘油明胶封片，镜检，观察肝组织脂肪病变程度。
1.7 天狼星红染色
石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水5 min×3次，滴加天狼星红染色液，30 °C孵育30 min，无水乙醇冲洗，晾干后封片。
1.8 Western Blot检测
将肾组织加入预冷的RIPA裂解液提取蛋白，BCA法（美国Thermo scientific公司，型号23227）测定总蛋白浓度。4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清。取20 µg样品，10% SDS-PAGE电泳，100 V转移1 h至PVDF膜，封闭1 h；一抗TNF-α（1∶500）（英国Abcam，货号1793）及SREBP1（1∶2 000） （英国Abcam，货号28481）4 ℃过夜，二抗室温孵育45 min，ECL显影，采用Image J分析Western Blot的蛋白表达灰度值。
1.9 实时荧光定量PCR（RT-PCR）
Trizol法提取肝脏RNA，将提取的总RNA溶解于DEPC水，测RNA浓度。逆转录：按日本Takara逆转录试剂盒（RR037A）进行，反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 15 min。扩增：取cDNA 3 μL加SYBR Green 5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 1.2 μL，制成10 μL体系，条件为：95 ℃、30 min预变性，95 ℃、5 s变性，60 ℃、30 s退火，40个循环，60 ℃、1 min延伸。18S rRNA为内参，2-ΔΔCt法分析计算目的基因表达。检测：α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、结蛋白（Desmin）、TNF-α、IL-6、脂肪酸合酶（FASN）和固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）mRNA表达，引物由中国上海生工合成，引物序列见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequence名称 序列 18S F：5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3'
R：5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'
TNF-α F：5'-ATGAGAGGGAGGCCATTTG-3'
R：5'-CAGCCTCTTCTCATTCCTGC-3'
IL-6 F：5'-ACCAGAGGAAATTTTCAATAGGC-3'
R：5'-TGATGCACTTGCAGAAAACA-3'
FASN F：5'-GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT-3'
R：5'-TGGGTAATCCATAGAGCCCAG-3'
SREBP -1c F：5'-GCAGCCACCATCTAGCCTG-3' R 5'-CAGCAGTGAGTCTGCCTTGAT-3' α-SMA F 5'-GTTCAGTGGTGCCTCTGTCA-3' R 5'-ACTGGGACGACATGGAAAAG-3' Desmin F 5'-TCGGCTCTAAGGGCTCCTC-3' R 5'-CGTGGTCAGAAACTCCTGGTT-3' 1.10 统计学方法
使用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料以
2. 结果
2.1 研究人群基本特征
对照组25例，其中男16例，女9例；平均年龄（41.88±12.12）岁。NAFLD组25例，其中男14例，女11例，平均年龄（48.38±13.82）岁。两组年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。
表 2 研究对象血脂与肾功能参数的分析Table 2. Analysis of blood lipids and renal function parameters in subjects组别 例数 年龄（岁） BUN（mmol/L） Cr（μmol/L） UA（μmol/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L） 对照组 25 41.88±12.12 4.33±1.02 53.52±3.06 265.00±9.43 4.14±0.78 1.15±0.53 NAFLD组 25 48.38±13.82 4.49±1.04 79.33±3.06 381.00±18.87 6.21±1.21 3.01±1.32 t值 1.73 2.05 5.97 5.50 15.00 13.23 P值 0.090 0.012 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 2.2 两组患者血脂与肾功能参数比较
NAFLD组尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、尿酸（UA）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）水平均高于对照组（P值均<0.05）（表2）。
2.3 下瘀血汤对HFD组小鼠的体质量、血脂及肾功能的影响
与LFD组相比，HFD组小鼠体质量明显增加（P<0.05），TC、TG、BUN及Cr水平均明显升高（P值均<0.05）；XYXD组与HFD组相比，TC、TG、BUN及CR水平均下降，差异均有统计学意义（P值均<0.001）（表3）。
表 3 各组小鼠体质量肾功能、血脂表达改变Table 3. Changes in body weight， renal function， and lipid expression of mice in each group组别 动物数（只） 体质量（g） BUN（mmol/L） Cr（μmol/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L） LFD组 8 30.74±2.34 6.14±0.38 5.29±0.30 2.63±0.23 0.53±0.03 HFD组 8 46.34±2.271） 7.49±0.121） 8.63±0.221） 5.46±0.141） 0.83±0.031） XYXD组 8 37.98±2.842） 6.64±0.252） 7.53±0.142） 3.62±0.192） 0.71±0.022） F值 78.13 75.70 432.41 474.30 312.04 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：与LFD组比较，1）P<0.001；与HFD组比较，2）P<0.001。
2.4 下瘀血汤对HFD组小鼠肝脏炎症及脂肪变的影响
HE染色结果显示：LFD组肝小叶结构正常，肝细胞索从中央静脉呈放射状排列；HFD组小鼠小叶间炎性细胞浸润明显，脂肪变明显，炎症细胞浸润。与HFD组比较，下瘀血汤显著抑制炎性浸润，脂肪变显著减轻（P<0.001）。油红O显色提示：HFD组小鼠肝细胞内可见红色脂滴填充，形状不规则的脂滴排列紧密；XYXD组脂滴较HFD组脂滴减少。各组油红O染色阳性面积百分比差异有统计学意义，其中HFD组显著高于LFD组，XYXD组与HFD组相比，油红O染色阳性面积显著降低（P值均<0.001）（图1）。
2.5 下瘀血汤可对HFD组小鼠肾脏炎症、胶原形成及脂肪变的影响
肾组织HE染色显示：LFD组小鼠肾组织结构正常；HFD组小鼠肾小球系膜细胞和基质增多，可见间质细胞增多，炎症细胞浸润，肾小管上皮细胞淡染，胞质增多；XYXD组肾小球面积略有缩小，系膜增生明显减轻（图2）。油红O染色结果显示：与LFD组相比，HFD组可见大量红色脂滴填充，脂肪沉积明显；与HFD组相比，XYXD组脂滴明显减少，脂肪沉积显著减少（图2）。与LFD组相比，HFD组油红O染色阳性面积显著增加，下瘀血汤干预后显著减少（P值均<0.05）（表4）。天狼星红染色结果显示：与LFD组相比，HFD组肾小球及皮质胶原纤维沉积显著增多，正常结构遭到破坏，增生的胶原明显，而XYXD组可显著抑制胶原沉积明显减轻（图2）。
表 4 各组小鼠肾脏病理学、炎症纤维化指标变化Table 4. Changes of pathological in each group指标 LFD组 HFD组 XYXD组 F值 P值 NAS评分（分） 0.65±0.05 6.04±0.461） 3.61±0.192） 8.74 <0.001 天狼星红染色阳性面积百分比（%） 2.20±0.34 5.45±0.171） 3.26±0.122） 23.73 <0.001 油红O染色阳性面积百分比（%） 7.44±0.87 21.05±0.931） 14.88±0.152） 1.33 <0.001 免疫印迹 TNF-α 1.00±0.22 11.06±2.691） 8.49±2.672） 16.67 <0.001 SREBP-1 1.00±0.03 2.36±0.281） 1.16±0.272） 28.59 <0.001 免疫组化染色阳性面积百分比（%） CD68 0.25±0.06 1.77±0.201） 0.92±0.082） 4.94 <0.001 α-SMA 0.48±0.09 2.29±0.151） 1.49±0.152） 2.71 <0.001 CD68+α-SMA双染色 1.69±0.27 4.79±0.501） 3.40±0.492） 64.54 <0.001 RT-PCR TNF-α 1.00±0.21 2.14±0.491） 1.32±0.192） 26.12 <0.001 IL-6 1.00±0.27 2.34±0.971） 1.21±0.122） 12.92 <0.001 FASN 1.00±0.21 10.05±1.131） 7.30±0.842） 35.42 <0.001 SREBP-1c 1.00±0.35 11.76±1.251） 9.06±1.032） 25.82 <0.001 Desmin 1.00±0.18 2.15±0.871） 1.11±0.192） 11.86 <0.001 α-SMA 1.00±0.57 3.76±0.731） 1.70±0.262） 53.53 <0.001 注：与 LFD组比较，1）P<0.001；与 HFD 组比较：2）P<0.001。
RT-PCR结果显示：与LFD组相比，HFD组TNF-α、IL-6、FASN、SREBP1、Desmin及α-SMA mRNA均显著上升（P值均<0.001）（表4）；与HFD组相比，XYXD组可显著降低其表达（P值均<0.001）。Western Blot结果显示：与LFD组比较，HFD组SREBP1及TNF-α蛋白表达水平上调（P值均<0.05）；与HFD组比较，XYXD组SREBP1及TNF-α蛋白表达水平下调（P值均<0.05）（图3，表4）。
2.6 下瘀血汤对HFD组小鼠肾脏胶原沉积的影响
LFD组小鼠肾组织α-SMA表达较低，HFD组小鼠α-SMA呈强阳性表达，主要分布在肾小球系膜增生和胶原形成；XYXD组α-SMA阳性表达显著下调。CD68在LFD组小鼠肾组织中表达较低，呈弱阳性表达；HFD组小鼠肾组织CD68主要分布在肾小管周围，呈强阳性表达，与α-SMA阳性表达位置相靠近（图4）。免疫组化结果显示：与LFD组相比，HFD组α-SMA、CD68表达及双染阳性表达均显著升高（P值均<0.05），XYXD显著抑制α-SMA、CD68表达及双染阳性表达（P值均<0.05）（表4）。
注： 细箭头，α-SMA（棕色）；粗箭头，CD68（蓝色）。图 4 肾组织免疫组化染色结果（×600）Figure 4. Renal tissue immunohistochemical results（×600）3. 讨论
近年来，不健康的饮食及生活习惯导致NAFLD已迅速成为全球最常见的慢性肝病，目前估计影响全球高达38%的成年人口［1］。NAFLD患者发生慢性肾功能不全（chronic kidney disease，CKD）的风险随着肝脂肪变性的严重程度而增加［14-15］。5%～35%的NAFLD患者罹患CKD，NAFLD成为慢性肾病的一个新兴危险因素［16］，但两者之间的机制研究目前报道较少。临床上无论是NAFLD还是CKD目前都缺乏有效治疗药物。本研究临床结果显示，与健康对照组相比，NAFLD组患者血脂及肾功能指标均升高（P值均<0.05），提示NAFLD患者存在一定程度的肾损伤。同样，在HFD小鼠中发现，其存在肝脏脂肪变及炎症的同时，肾功能及肾脏病理学亦发生变化，包括脂肪变、炎症及胶原形成。
中医强调“肝肾同源”，肝肾在生理、病理上均密切相关，依据肝肾同源理论肝肾精血同源相生，肝病日久，精血衰弱，肾脏运化功能受到影响，故肝功能异常，肾功能也会出现不同程度的变化［17-18］。NAFLD病位在肝，与肝、脾、肾三脏有关，其性质是本虚标实，即肝肾亏虚为本，痰湿血瘀为标。其病机或先天不足，气血亏耗，肾阴阳皆亏，气血停滞，痰瘀湿浊内生，瘀阻肝脉；或脾胃运化失司，水谷不化，液聚脂凝，阻滞于肝筋膜间；或怒气暴伤，气机失调，津液输布失常，郁阻于三焦膜原；或劳逸失调或瘀血内滞［19］。
下瘀血汤由大黄、桃仁和土鳖虫三味中药组成，是活血化瘀的经典方剂，主治瘀阻腹痛及瘀血阻滞、腹中癥块等，包含大黄素、大黄酸、苦杏仁苷等多种活性成分［8］。中医专家共识［12，20-21］意见认为，NAFLD以肝体用失调、脾肾亏虚为主要特点，痰、湿、瘀、热等为主要病理因素，既往研究［22-23］证实，活血化瘀药物可以发挥改善包括肾纤维化在内的肾损伤作用，因此，在理论上下瘀血汤适用于肝肾同治。
本课题组既往实验研究［9］已经证实下瘀血汤对MCD诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型治疗有效。本研究通过HFD诱导的NAFLD模型发现，下瘀血汤可以改善肾小球系膜增生和肾脏胶原生成，减少炎症细胞浸润肾小球炎症。同时，HFD组小鼠TC、TG及Cr、BUN较LFD组升高明显，而XYXD组可改善高血脂及肾功能水平。免疫组化提示，与LFD组相比，HFD组α-SMA和CD68单染及双染阳性均显著升高（P值均<0.05），下瘀血汤显著抑制双阳性染色（P值均<0.05），XYXD组中CD68及α-SMA阳性表达较HFD组明显减少；RT-PCR提示XYXD组同时下调SREBP1、FASN、IL-6、TNF-α、Desmin和α-SMA的mRNA相对表达量，而免疫印迹也同样证实在HFD模型中，脂质代谢因子SREBP1及炎症标志物TNF-α蛋白表达较LFD组明显升高，而下瘀血汤可下调SREBP1及TNF-α蛋白表达。
TNF-α主要由浸润于肾间质中的巨噬细胞、肾小球系膜细胞和小管上皮细胞产生，在CKD中TNF-α可以通过活化核因子-κB信号通路介导炎性介质的转录与表达，加重肾损伤。IL是在多种细胞内广泛分布的细胞因子，通过激活及调节免疫系统，介导机体的炎症反应。IL-6等炎症因子的升高在CKD患者体内通过激活炎症反应的级联诱发炎症风暴，加剧肾脏的炎性损伤［24］。国内外有关NAFLD与肾损伤间关系的研究很少，相关机制尚不清楚。有研究［25］表明，巨噬细胞的汇聚是慢性肾脏疾病进展过程中的一个显著特征，与肾小球滤过率下降、预后不良密切相关。本研究提示HFD诱导的模型小鼠出现了肾脏脂肪变、炎症浸润及胶原沉积和胶原形成，下瘀血汤可通过抑制脂质代谢水平，抑制巨噬细胞产生促炎因子，从而减少肌成纤维细胞形成而发挥肾脏保护作用。
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注： 细箭头，α-SMA（棕色）；粗箭头，CD68（蓝色）。
图 4 肾组织免疫组化染色结果（×600）
Figure 4. Renal tissue immunohistochemical results（×600）
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequence
名称 序列 18S F：5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3'
R：5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'
TNF-α F：5'-ATGAGAGGGAGGCCATTTG-3'
R：5'-CAGCCTCTTCTCATTCCTGC-3'
IL-6 F：5'-ACCAGAGGAAATTTTCAATAGGC-3'
R：5'-TGATGCACTTGCAGAAAACA-3'
FASN F：5'-GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT-3'
R：5'-TGGGTAATCCATAGAGCCCAG-3'
SREBP -1c F：5'-GCAGCCACCATCTAGCCTG-3' R 5'-CAGCAGTGAGTCTGCCTTGAT-3' α-SMA F 5'-GTTCAGTGGTGCCTCTGTCA-3' R 5'-ACTGGGACGACATGGAAAAG-3' Desmin F 5'-TCGGCTCTAAGGGCTCCTC-3' R 5'-CGTGGTCAGAAACTCCTGGTT-3' 
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表 2 研究对象血脂与肾功能参数的分析
Table 2. Analysis of blood lipids and renal function parameters in subjects
组别 例数 年龄（岁） BUN（mmol/L） Cr（μmol/L） UA（μmol/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L） 对照组 25 41.88±12.12 4.33±1.02 53.52±3.06 265.00±9.43 4.14±0.78 1.15±0.53 NAFLD组 25 48.38±13.82 4.49±1.04 79.33±3.06 381.00±18.87 6.21±1.21 3.01±1.32 t值 1.73 2.05 5.97 5.50 15.00 13.23 P值 0.090 0.012 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
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表 3 各组小鼠体质量肾功能、血脂表达改变
Table 3. Changes in body weight， renal function， and lipid expression of mice in each group
组别 动物数（只） 体质量（g） BUN（mmol/L） Cr（μmol/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L） LFD组 8 30.74±2.34 6.14±0.38 5.29±0.30 2.63±0.23 0.53±0.03 HFD组 8 46.34±2.271） 7.49±0.121） 8.63±0.221） 5.46±0.141） 0.83±0.031） XYXD组 8 37.98±2.842） 6.64±0.252） 7.53±0.142） 3.62±0.192） 0.71±0.022） F值 78.13 75.70 432.41 474.30 312.04 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：与LFD组比较，1）P<0.001；与HFD组比较，2）P<0.001。
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表 4 各组小鼠肾脏病理学、炎症纤维化指标变化
Table 4. Changes of pathological in each group
指标 LFD组 HFD组 XYXD组 F值 P值 NAS评分（分） 0.65±0.05 6.04±0.461） 3.61±0.192） 8.74 <0.001 天狼星红染色阳性面积百分比（%） 2.20±0.34 5.45±0.171） 3.26±0.122） 23.73 <0.001 油红O染色阳性面积百分比（%） 7.44±0.87 21.05±0.931） 14.88±0.152） 1.33 <0.001 免疫印迹 TNF-α 1.00±0.22 11.06±2.691） 8.49±2.672） 16.67 <0.001 SREBP-1 1.00±0.03 2.36±0.281） 1.16±0.272） 28.59 <0.001 免疫组化染色阳性面积百分比（%） CD68 0.25±0.06 1.77±0.201） 0.92±0.082） 4.94 <0.001 α-SMA 0.48±0.09 2.29±0.151） 1.49±0.152） 2.71 <0.001 CD68+α-SMA双染色 1.69±0.27 4.79±0.501） 3.40±0.492） 64.54 <0.001 RT-PCR TNF-α 1.00±0.21 2.14±0.491） 1.32±0.192） 26.12 <0.001 IL-6 1.00±0.27 2.34±0.971） 1.21±0.122） 12.92 <0.001 FASN 1.00±0.21 10.05±1.131） 7.30±0.842） 35.42 <0.001 SREBP-1c 1.00±0.35 11.76±1.251） 9.06±1.032） 25.82 <0.001 Desmin 1.00±0.18 2.15±0.871） 1.11±0.192） 11.86 <0.001 α-SMA 1.00±0.57 3.76±0.731） 1.70±0.262） 53.53 <0.001 注：与 LFD组比较，1）P<0.001；与 HFD 组比较：2）P<0.001。
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[1] TARGHER G, BYRNE CD, TILG H. MASLD: A systemic metabolic disorder with cardiovascular and malignant complications[J]. Gut, 2024, 73( 4): 691- 702. DOI: 10.1136/gutjnl-2023-330595. [2] ESLAM M, AHMED A, DESPRÉS JP, et al. Incorporating fatty liver disease in multidisciplinary care and novel clinical trial designs for patients with metabolic diseases[J]. Lancet Gastroenterol Hepatol, 2021, 6( 9): 743- 753. DOI: 10.1016/S2468-1253(21)00132-1. [3] PAIK JM, HENRY L, YOUNOSSI ZM. Nonalcoholic fatty liver disease mortality may not be decreasing: A need for careful interpretation of GBD 2019 estimates of liver deaths[J]. Cell Metab, 2023, 35( 7): 1087- 1088. DOI: 10.1016/j.cmet.2023.06.012. [4] MANTOVANI A, PETRACCA G, BEATRICE G, et al. Non-alcoholic fatty liver disease and risk of incident chronic kidney disease: An updated meta-analysis[J]. Gut, 2022, 71( 1): 156- 162. DOI: 10.1136/gutjnl-2020-323082. [5] DAI KM. Jiang Chunhua’s experience in applying Xiayuxue Decoction[J]. Shanxi J Tradit Chin Med, 2012, 28( 1): 4- 6. DOI: 10.3969/j.issn.1000-7156.2012.01.002.戴克敏. 姜春华运用下瘀血汤的经验[J]. 山西中医, 2012, 28( 1): 4- 6. DOI: 10.3969/j.issn.1000-7156.2012.01.002. [6] SHEN DX, MA WT, WU L, et al. Mechanism of Xiayuxue Decoction on improving liver fibrosis by inhibiting pancreatic macrophage infiltration[J]. Acad J Shanghai Univ Tradit Chin Med, 2019, 33( 2): 66- 72, 79. DOI: 10.16306/j.1008-861x.2019.02.015.沈东晓, 马文婷, 吴柳, 等. 下瘀血汤抑制胰腺巨噬细胞浸润改善肝纤维化的机制研究[J]. 上海中医药大学学报, 2019, 33( 2): 66- 72, 79. DOI: 10.16306/j.1008-861x.2019.02.015. [7] LIU C, CAI J, CHENG Z, et al. Xiayuxue decoction reduces renal injury by promoting macrophage apoptosis in hepatic cirrhotic rats[J]. Genet Mol Res, 2015, 14( 3): 10760- 10773. DOI: 10.4238/2015.September.9.15. [8] DING SD, CHEN BC, LIU Y, et al. Proteomic study of Xiayuxue Decoction on liver cirrhosis of rats[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2012, 43( 1): 131- 138.丁赛丹, 陈必成, 刘艳, 等. 下瘀血汤干预肝硬化大鼠的蛋白质组学研究[J]. 中草药, 2012, 43( 1): 131- 138. [9] WU L, ZHANG J, MA WT, et al. Xiayuxue decoction inhibits methionine-choline-deficient-induced nonalcoholic steatohepatitis in mice[J/CD]. Chin J Liver Dis Electron Version, 2018, 10( 3): 48- 55. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7380.2018.03.009.吴柳, 张洁, 马文婷, 等. 下瘀血汤对胆碱蛋氨酸缺乏诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎的抑制作用[J/CD]. 中国肝脏病杂志(电子版), 2018, 10( 3): 48- 55. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7380.2018.03.009. [10] WU L, YANG GY, ZHANG J, et al. Xiayuxue decoction improved HFD-induced-nonalcoholic steatohepatitis mice by down-regulating NLRP3[J]. Chin J Integr Tradit West Med, 2020, 40( 10): 1202- 1208. DOI: 10.7661/j.cjim.20200904.336.吴柳, 杨广越, 张洁, 等. 下瘀血汤下调NLRP3改善高脂饮食诱导小鼠非酒精性脂肪性肝炎[J]. 中国中西医结合杂志, 2020, 40( 10): 1202- 1208. DOI: 10.7661/j.cjim.20200904.336. [11] HOU LQ, WANG ZY, ZHAO X, et al. Therapeutic effect and mechanism of Xiayuxue Decoction on mouse model of nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet[J]. J Clin Hepatol, 2024, 40( 4): 712- 719. DOI: 10.12449/JCH240412.侯林圻, 王知意, 赵鑫, 等. 下瘀血汤对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病小鼠模型的治疗作用及机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2024, 40( 4): 712- 719. DOI: 10.12449/JCH240412. [12] National Workshop on Fatty Liver and Alcoholic Liver Disease, Chinese Society of Hepatology, Chinese Medical Association; Fatty Liver Expert Committee, Chinese Medical Doctor Association. Guidelines of prevention and treatment for nonalcoholic fatty liver disease: A 2018 update[J]. J Clin Hepatol, 2018, 34( 5): 947- 957. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2018.05.007.中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组, 中国医师协会脂肪性肝病专家委员会. 非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)[J]. 临床肝胆病杂志, 2018, 34( 5): 947- 957. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2018.05.007. [13] TAO L, YANG GY, SUN TT, et al. Capsaicin receptor TRPV1 maintains quiescence of hepatic stellate cells in the liver via recruitment of SARM1[J]. J Hepatol, 2023, 78( 4): 805- 819. DOI: 10.1016/j.jhep.2022.12.031. [14] GAO JL, LI YH, ZHANG YJ, et al. Severity and remission of metabolic dysfunction-associated fatty/steatotic liver disease with chronic kidney disease occurrence[J]. J Am Heart Assoc, 2024, 13( 5): e032604. DOI: 10.1161/JAHA.123.032604. [15] OU FB, LUO SH, LI XF, et al. Metabolic-associated fatty liver disease as a driver of chronic kidney disease[J]. J Clin Exp Med, 2023, 22( 4): 443- 447. DOI: 10.3969/j.issn.1671-4695.2023.04.030.欧芳波, 罗沈晖, 李学锋, 等. 代谢相关脂肪性肝病:慢性肾脏病的一个启动因素[J]. 临床和实验医学杂志, 2023, 22( 4): 443- 447. DOI: 10.3969/j.issn.1671-4695.2023.04.030. [16] RATZIU V, HARRISON SA, LOUSTAUD-RATTI V, et al. Hepatic and renal improvements with FXR agonist vonafexor in individuals with suspected fibrotic NASH[J]. J Hepatol, 2023, 78( 3): 479- 492. DOI: 10.1016/j.jhep.2022.10.023. [17] WANG YH, CHEN WD, LI HM, et al. Application of the theory of“homology of liver and kidney” in the treatment of nonalcoholic fatty liver disease[J]. Chin J Integr Tradit West Med Liver Dis, 2023, 33( 8): 765- 768. DOI: 10.3969/j.issn.1005-0264.2023.008.023.王俞涵, 陈伟栋, 厉蕙萌, 等.“肝肾同源” 理论在非酒精性脂肪性肝病治疗中的应用[J]. 中西医结合肝病杂志, 2023, 33( 8): 765- 768. DOI: 10.3969/j.issn.1005-0264.2023.008.023. [18] QIU HT, YU XM. Syndrome differentiation and treatment of chronic nephropathy from hepatorenal homology[J]. Chin Med Mod Distance Educ China, 2023, 21( 5): 71- 74. DOI: 10.3969/j.issn.1672-2779.2023.05.027.邱海彤, 于秀梅. 从肝肾同源辨治慢性肾病[J]. 中国中医药现代远程教育, 2023, 21( 5): 71- 74. DOI: 10.3969/j.issn.1672-2779.2023.05.027. [19] CHEN P, LOU J. Discussion on nonalcoholic fatty liver disease with liver and kidney deficiency based on“homogeny of liver and kidney” theory[J]. Tradit Chin Med Res, 2022, 35( 12): 4- 8. DOI: 10.3969/j.issn.1001-6910.2022.12.02.陈萍, 娄静. 基于“肝肾同源” 理论探讨肝肾不足型非酒精性脂肪性肝病的治疗[J]. 中医研究, 2022, 35( 12): 4- 8. DOI: 10.3969/j.issn.1001-6910.2022.12.02. [20] Branch of Gastrointestinal Diseases, China Association of Chinese Medicine. Expert consensus on TCM diagnosis and treatment of nonalcoholic fatty liver disease(2017)[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33( 12): 2270- 2274. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2017.12.002.中华中医药学会脾胃病分会. 非酒精性脂肪性肝病中医诊疗专家共识意见(2017)[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33( 12): 2270- 2274. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2017.12.002. [21] Liver Disease Committee, Chinese Association of Integrative Medicine. Guidelines for the diagnosis and treatment of liver fibrosis in integrative medicine practice(2019)[J]. J Clin Hepatol, 2019, 35( 7): 1444- 1449. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2019.07.007.中国中西医结合学会肝病专业委员会. 肝纤维化中西医结合诊疗指南(2019年版)[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35( 7): 1444- 1449. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2019.07.007. [22] LYU B, YANG MB, XIAO HB. Research on intervention mechanism of tanshinone type IIA sulfonate of adriamycin nephrosis rats kidney injury[J]. Chin Arch Tradit Chin Med, 2015, 33( 10): 2470- 2472, 26. DOI: 10.13193/j.issn.1673-7717.2015.10.051.吕波, 杨茂波, 肖洪彬. 丹参酮IIA磺酸钠对阿霉素肾病大鼠肾损伤的干预机制研究[J]. 中华中医药学刊, 2015, 33( 10): 2470- 2472, 26. DOI: 10.13193/j.issn.1673-7717.2015.10.051. [23] LIU Y, LI W. Pathogenesis and treatment of renal interstitial fibrosis based on collateral disease theory[J]. Chin J Basic Med Tradit Chin Med, 2019, 25( 11): 1521- 1524. DOI: 10.19945/j.cnki.issn.1006-3250.2019.11.015.刘瑶, 李伟. 基于络病理论的肾间质纤维化病机及治疗初探[J]. 中国中医基础医学杂志, 2019, 25( 11): 1521- 1524. DOI: 10.19945/j.cnki.issn.1006-3250.2019.11.015. [24] CORMICAN S, NEGI N, NAICKER SD, et al. Chronic kidney disease is characterized by expansion of a distinct proinflammatory intermediate monocyte subtype and by increased monocyte adhesion to endothelial cells[J]. J Am Soc Nephrol, 2023, 34( 5): 793- 808. DOI: 10.1681/ASN.0000000000000083. [25] LI XZ, BHATTACHARYA D, YUAN Y, et al. Chronic kidney disease in a murine model of non-alcoholic steatohepatitis(NASH)[J]. Kidney Int, 2024, 105( 3): 540- 561. DOI: 10.1016/j.kint.2023.12.009. -
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