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芪术方对高脂高果糖高胆固醇诱导的非酒精性脂肪性肝病小鼠模型的影响及其机制

陈佳豪 周振华

引用本文:
Citation:

芪术方对高脂高果糖高胆固醇诱导的非酒精性脂肪性肝病小鼠模型的影响及其机制

DOI: 10.12449/JCH241113
基金项目: 

上海市2021年度“科技创新行动计划”生物医药科技支撑专项 (21S1900400);

安徽省自然科学基金 (2308085MH293);

安徽省高校科学研究重大项目 (2023AH040098);

安徽省卫生健康科研重点项目 (AHWJ2023A10035);

国家中医药管理局高水平中医药重点学科建设项目(中医肝胆病学) (zyyzdxk-2023060)

伦理学声明:本研究方案于2023年3月29日经由上海中医药大学实验动物伦理委员会审批,批号:PZSHUTCM2304110001,符合实验室动物管理与使用准则。
利益冲突声明:本文不存在任何利益冲突。
作者贡献声明:陈佳豪负责动物相关实验,数据统计及文章初稿;周振华负责拟定写作思路,指导撰写文章并最后定稿。
详细信息
    通信作者:

    周振华, jinghua1220@163.com (ORCID: 0000-0002-5639-3857)

Effect of Qizhu prescription on a mouse model of non-alcoholic fatty liver disease incluced by high-fat, high-fructose, and high-cholesterol diet and its mechanism

Research funding: 

Shanghai 2021 “Science and Technology Innovation Action Plan” Biomedical Science and Technology Support Special Project (21S1900400);

Natural Science Foundation of Anhui Province (2308085MH293);

Key Scientific Research Project of Anhui Province (2023AH040098);

Health as a key project of scientific research in anhui province (AHWJ2023A10035);

The state administration of traditional Chinese medicine high level key discipline construction project of traditional Chinese medicine (TCM liver epidemiology) (zyyzdxk-2023060)

More Information
  • 摘要:   目的  探讨芪术方对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠模型的疗效及作用机制。  方法  60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组,模型组,芪术方低(4.75 g/kg)、中(9.50 g/kg)、高剂量组(19.00 g/kg),多唏磷脂酰胆碱组(磷脂组)(228 mg/kg),每组10只。高脂高胆固醇饲料和20%果糖水造模16周后,各组给予相应药物干预,每天给药1次,连续8周。检测血清ALT、AST、TC、TG、LDL;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清游离脂肪酸(FFA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA);苏木素-伊红(HE)和油红O染色观察肝组织病理变化;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测微管相关蛋白轻链3B(LC3BⅡ‍/‍Ⅰ‍)、螯合体(p62/SQSTM1)、Beclin-1、动力相关蛋白1(Drp1)表达。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1 mRNA表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。  结果  与正常组比较,模型组血清TG、TC、ALT、AST、LDL、FFA、TNF-α、IL-1β、MDA水平均升高,SOD水平降低(P值均<0.05)。HE染色结果显示,模型组小鼠肝组织可见肝细胞脂肪变及大量脂肪空泡;油红O染色结果显示,模型组小鼠肝细胞内有大量大小不一红色脂滴沉积,油红O染色面积百分比较正常组升高(P<0.05)。Real-time PCR结果显示,与正常组比较,模型组肝组织中Drp1、Beclin-1 mRNA升高,p62/SQSTM1 mRNA降低(P值均<0.05)。Western Blot结果显示,与正常组比较,模型组肝组织中Drp1、Beclin-1、LC3BⅡ‍/‍Ⅰ蛋白表达水平升高,p62/SQSTM1蛋白表达水平降低(P值均<0.05)。与模型组比较,部分剂量芪术方组和磷脂组血清TG、TC、ALT、AST、LDL、FFA、TNF-α、IL-1β、MDA水平均降低,SOD水平升高(P值均<0.05)。与模型组比较,各用药组肝组织脂肪变改善明显,且油红O染色面积百分比降低(P值均<0.05);Drp1、Beclin-1 mRNA降低,p62/SQSTM1 mRNA升高(P值均<0.05);Drp1、Beclin-1、LC3B Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平降低,部分用药组p62/SQSTM1蛋白表达水平升高(P值均<0.05),且芪术方中、高剂量效果更明显(P值均<0.01)。  结论  芪术方改善NAFLD小鼠肝脂质代谢及炎症水平可能与调控肝细胞线粒体自噬有关。

     

  • 图  1  各组小鼠肝组织HE染色(×200)

    注: a,正常组;b,模型组;c,芪术方低剂量组;d,芪术方中剂量组;e,芪术方高剂量组;f,磷脂组。

    Figure  1.  HE staining of liver tissues of mice in each group (×200)

    图  2  各组小鼠肝组织油红O染色(×200)

    注: a,正常组;b,模型组;c,芪术方低剂量组;d,芪术方中剂量组;e,芪术方高剂量组;f,磷脂组。

    Figure  2.  Oil red O staining of liver tissue of mice in each group (×200)

    图  3  各组小鼠肝组织超微结构(×6 000)

    注: a,正常组;b,模型组;c,芪术方中剂量组;d,芪术方高剂量组;e,磷脂组。黄色箭头代表脂滴,绿色箭头代表自噬溶酶体,红色箭头代表自噬小体。

    Figure  3.  Ultrastructure of liver tissue of mice in each group (×6 000)

    图  4  芪术方对各组小鼠Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1、LC3B/蛋白表达的影响

    注: A,正常组;B,模型组;C,芪术方低剂量组;D,芪术方中剂量组;E,芪术方高剂量组;F,磷脂组。

    Figure  4.  Effect of Qizhu formula on the expression of Drp1, Beclin-1, p62/SQSTM1 and LC3B / in each group of mice

    表  1  PCR引物序列

    Table  1.   PCR Primer sequence

    基因 引物序列
    Drp1 上游 5'-AACAGGCAACTGGAGAGGAA-3'
    下游 5'-GCAACTGGAACTGGCACATT-3'
    Beclin-1 上游 5-CCAATGTCTTCAATGCCACCTTC-3'
    下游 5'-AGGCAGCATTGATTTCATTCCAC-3'
    p62/SQSTM1 上游 5'-CCTTGCCCTACAGCTGAGTC-3'
    下游 5'-CATGTTCCACATCAATGTCAACC-3'
    GAPDH 上游 5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'
    下游 5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'
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    表  2  各组小鼠肝功能及血脂水平

    Table  2.   Effects on liver function and blood glucose of mice in each group

    组别 动物数(只) AST(U/L) ALT(U/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L) LDL(mmol/L)
    正常组 6 81.00±31.77 29.33±5.61 2.45±0.11 0.74±0.20 0.44±0.04
    模型组 6 179.30±57.571) 142.70±72.791) 6.28±0.651) 0.99±0.251) 1.43±0.281)
    芪术方低剂量组 6 117.00±33.002) 70.33±30.532) 4.18±0.222) 0.67±0.092) 0.92±0.232)
    芪术方中剂量组 6 90.33±17.082) 31.33±4.842) 3.83±0.682) 0.56±0.092) 0.60±0.122)
    芪术方高剂量组 6 81.67±10.842) 26.33±4.082) 3.76±0.202) 0.58±0.062) 0.63±0.072)
    磷脂组 6 91.00±21.462) 26.67±4.132) 4.18±0.402) 0.59±0.052) 0.73±0.072)
    F 8.232 12.26 48.40 7.41 28.69
    P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

    注:与正常组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05。

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    表  3  各组小鼠油红O染色面积百分比

    Table  3.   Percentage of oil red stained area in each group of mice

    组别 动物数(只) 油红O染色阳性面积(%)
    正常组 3 0.76±0.42
    模型组 3 40.40±7.731)
    芪术方低剂量组 3 25.80±3.472)
    芪术方中剂量组 3 11.55±2.473)
    芪术方高剂量组 3 7.81±1.783)
    磷脂组 3 10.93±3.983)
    F 38.43
    P <0.001

    注:与正常组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05,3)P<0.01。

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    表  4  各组小鼠TNF-αIL-1β、FFA、MDA及SOD表达水平

    Table  4.   Expression levels of TNF-α, IL-1β, FFA, MDA and SOD in each group of mice

    组别 动物数(只) TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL) FFA(μmol/L) MDA(nmol/mL) SOD(U/L)
    正常组 6 575.80±75.86 106.90±10.45 688.50±58.02 1.79±0.18 213.30±50.51
    模型组 6 1 976.00±141.201) 206.90±18.001) 1 122.00±102.601) 3.00±0.281) 92.62±6.331)
    芪术方低剂量组 6 1 554.00±109.002) 177.50±21.232) 990.80±99.88 2.10±0.102) 201.80±17.612)
    芪术方中剂量组 6 1 259.00±144.002) 166.40±16.553) 961.90±95.942) 2.01±0.103) 284.90±54.903)
    芪术方高剂量组 6 1 000.00±98.932) 138.50±9.643) 888.30±88.713) 1.97±0.173) 396.10±27.593)
    磷脂组 6 805.50±120.602) 127.80±16.253) 771.10±104.103) 2.07±0.063) 476.00±58.713)
    F 114.70 31.62 17.04 39.73 69.36
    P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

    注:与正常组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05,3)P<0.01。

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    表  5  各组小鼠Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1 mRNA表达水平

    Table  5.   mRNA expression levels of Drp1, Beclin-1, and p62/SQSTM1 in each group of mice

    组别 动物数(只) Drp1 Beclin-1 p62/SQSTM1
    正常组 6 1.00±0.19 1.00±0.19 1.00±0.14
    模型组 6 2.07±0.391) 2.54±0.631) 0.26±0.111)
    芪术方低剂量组 6 1.43±0.222) 1.67±0.262) 0.84±0.17
    芪术方中剂量组 6 1.16±0.222) 1.31±0.122) 1.11±0.952)
    芪术方高剂量组 6 1.05±0.272) 1.02±0.242) 1.22±0.502)
    磷脂组 6 1.14±0.282) 0.97±0.402) 0.61±0.17
    F 13.41 18.55 3.70
    P <0.001 <0.001 0.010

    注:与正常组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05。

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    表  6  各组小鼠Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1、LC3B /蛋白表达水平

    Table  6.   Protein expression levels of Drp1, Beclin-1, p62/SQSTM1 and LC3B / in each group of mice

    组别 动物数(只) Drp1 Beclin-1 p62/SQSTM1 LC3B Ⅱ/LC3 ‍Ⅰ
    正常组 6 0.64±0.03 0.68±0.01 1.04±0.09 1.35±0.34
    模型组 6 1.27±0.061) 1.28±0.031) 0.24±0.011) 3.61±1.731)
    芪术方低剂量组 6 0.93±0.172) 1.08±0.043) 0.55±0.05 1.35±0.413)
    芪术方中剂量组 6 0.74±0.083) 0.82±0.113) 0.86±0.063) 1.24±0.303)
    芪术方高剂量组 6 0.66±0.213) 0.68±0.023) 0.93±0.063) 1.21±0.423)
    磷脂组 6 0.49±0.143) 0.93±0.073) 1.12±0.023) 1.23±0.473)
    F 14.08 50.99 116.50 4.36
    P <0.001 <0.001 <0.001 0.017

    注:与正常组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05,3)P<0.01。

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出版历程
  • 收稿日期:  2024-05-23
  • 录用日期:  2024-07-11
  • 出版日期:  2024-11-25
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