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叶酸对邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）暴露导致小鼠胆汁淤积型肝损伤的保护作用
DOI: 10.12449/JCH241021
Protective effect of folic acid against cholestatic liver injury in mice caused by bis（2-ethylhexyl） phthalate exposure
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摘要:
目的 探讨叶酸对邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）暴露诱发小鼠胆汁淤积型肝损伤的保护作用及其机制。 方法 将ICR小鼠随机分为对照（Control）组、叶酸高剂量（H-FA）组、DEHP组、DEHP+叶酸低剂量（DEHP+L-FA）组、DEHP+叶酸高剂量（DEHP+H-FA）组，每组6只。H-FA组、DEHP+L-FA组和DEHP+H-FA组给予相应剂量的叶酸灌胃，Control组和DEHP组灌胃等量的PBS溶液。2 h后，DEHP组、DEHP+L-FA组和DEHP+H-FA组给予含200 mg/kg DEHP的玉米油，Control组和H-FA组灌胃等量的纯玉米油，共灌胃4周。记录小鼠每天的体质量和摄食量，收集血液和肝组织。生化仪检测血清总胆汁酸（TBA）和碱性磷酸酶（ALP）水平；HE染色观察肝组织病理变化；试剂盒检测肝组织丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量；LC-MS/MS检测小鼠血清胆汁酸谱；Western Blot法检测肝脏胆汁酸代谢相关蛋白的表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 与对照组相比，DEHP组小鼠每日摄食量明显下降，体质量从第10天开始显著降低（P值均<0.05）；与DEHP组相比，DEHP+L-FA组与DEHP+H-FA组小鼠的体质量和摄食量基本不变（P值均>0.05）。与对照组相比，DEHP组小鼠肝质量指数、血清TBA及ALP均显著升高（P值均<0.05），肝组织可见汇管区扩大，胆管变形增生及少量炎性细胞浸润；与DEHP组相比，DEHP+L-FA组与DEHP+H-FA组小鼠肝质量指数均明显下降（P值均<0.01），DEHP+H-FA组的血清TBA和ALP均显著下降（P值均<0.05），叶酸干预后小鼠肝组织形态结构明显改善。与对照组相比，DEHP组小鼠肝脏SOD含量明显下降（P<0.05），肝脏MDA含量明显增加（P<0.01）；与DEHP组相比，MDA和SOD含量在DEHP+H-FA组均显著回调（P值均<0.05）。与对照组相比，DEHP组小鼠血清中α-鼠胆酸（α-MCA）、β-鼠胆酸（β-MCA）、去氧胆酸（DCA）、石胆酸（LCA）、牛磺胆酸（TCA）、牛磺去氧胆酸（TDCA）、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）、牛磺-β-鼠胆酸（T-β-MCA）、牛磺-α-鼠胆酸（T-α-MCA）、牛磺猪去氧胆酸（THDCA）、牛磺石胆酸（TLCA）均明显升高（P值均<0.05），熊去氧胆酸（UDCA）明显降低（P<0.05）；与DEHP组相比，血清中DCA、LCA、TCA、TDCA、TUDCA、T-β-MCA、T-α-MCA、THDCA、TLCA在DEHP+H-FA组均明显回调（P值均<0.05）。与对照组相比，DEHP组小鼠肝脏FXR和CYP3A11蛋白表达量均明显增加（P值均<0.01），CYP7A1和MRP2蛋白表达量显著降低（P值均<0.01）；与DEHP组相比，肝脏FXR和CYP3A11蛋白表达量在DEHP+L-FA组和DEHP+H-FA组中均明显下调（P值均<0.05）；MRP2蛋白表达量在DEHP+L-FA组DEHP+H-FA组中均显著上调（P值均<0.05）；CYP7A1蛋白表达量在DEHP+H-FA组中显著上调（P<0.05）。 结论 叶酸对DEHP暴露导致的小鼠胆汁淤积型肝损伤有保护作用，其机制可能是调节胆汁酸合成、代谢与转运从而维持胆汁酸稳态。 -
关键词:
- 邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯 /
- 叶酸 /
- 胆汁淤积 /
- 胆汁酸类
Abstract:Objective To investigate the protective effect of folic acid against cholestatic liver injury in mice induced by bis（2-ethylhexyl） phthalate （DEHP） exposure and its mechanism. Methods ICR mice were randomly divided into control group， high-dose folic acid （H-FA） group， DEHP group， DEHP+low-dose folic acid （DEHP+L-FA） group， and DEHP+high-dose folic acid （DEHP+H-FA） group， with 6 mice in each group. The mice in the H-FA group， the DEHP+L-FA group， and the DEHP+H-FA group were given folic acid by gavage at the corresponding dose， and those in the control group and the DEHP group were given an equal volume of PBS solution by gavage. After 2 hours， the mice in the DEHP group， the DEHP+L-FA group， and the DEHP+H-FA group were given corn oil containing 200 mg/kg DEHP， and those in the control group and the H-FA group were given an equal volume of pure corn oil， by gavage for 4 weeks. Body weight and food intake were recorded every day， and blood and liver tissue samples were collected. A biochemical analyzer was used to measure the serum levels of total bile acid （TBA） and alkaline phosphatase（ALP）； HE staining was used to observe the histopathological changes of liver tissue； kits were used to measure the content of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） in the liver； LC-MS/MS was used to measure serum bile acid profiles； Western blot was used to measure the expression levels of proteins associated with hepatic bile acid metabolism. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the control group， the daily food intake of the mice in the DEHP group decreased significantly， and the body weight decreased significantly from day 10 （P<0.05）， and compared with the DEHP group， the DEHP+L-FA group and the DEHP+H-FA group had basically unchanged body weight and daily food intake （P>0.05）. Compared with the control group， the DEHP group had significant increases in liver weight index and the serum levels of TBA and ALP （all P<0.05）， with enlarged portal area， bile duct deformity and hyperplasia， and a small amount of inflammatory cell infiltration in liver tissue； compared with the DEHP group， the DEHP+L-FA group and the DEHP+H-FA group had a significant reduction in liver weight index （P<0.01）， and the DEHP+H-FA group had significant reductions in the serum levels of TBA and ALP （P<0.05）， with a significant improvement in liver histomorphology and structure after folic acid intervention. Compared with the control group， the DEHP group had a significant reduction in the content of SOD （P<0.05） and a significant increase in the content of MDA in the liver （P<0.01）， and compared with the DEHP group， the DEHP+H-FA group had significant reductions in the content of MDA and SOD （P<0.05）. Compared with the control group， the DEHP group had significant increases in the serum levels of α-muricholic acid （α-MCA），β- muricholic acid （β-MCA），deoxycholic acid （DCA）， lithocholic acid （LCA）， taurocholic acid （TCA）， taurodeoxycholic acid （TDCA）， tauroursodeoxycholic acid （TUDCA）， tauro-β-muricholic acid （T-β-MCA）， tauro-α-muricholic acid （T-α-MCA）， taurohyodeoxycholic acid （THDCA）， and taurolithocholic acid （TLCA） （P<0.05） and a significant reduction in ursodeoxycholic acid （UDCA）（P<0.05）； compared with the DEHP group， the DEHP+H-FA group had significant reductions in the serum levels of DCA， LCA， TCA， TDCA， TUDCA， T-β-MCA， T-α-MCA， THDCA， and TLCA （P<0.05）. Compared with the control group， the DEHP group had significant increases in the protein expression levels of FXR and CYP3A11 in the liver （P<0.01） and significant reductions in the protein expression levels of CYP7A1 and MRP2 （P<0.01）； compared with the DEHP group， the DEHP+L-FA group and the DEHP+H-FA group had significant reductions in the protein expression levels of FXR and CYP3A11 in the liver （P<0.05） and a significant increase in the protein expression level of MRP2 （P<0.05）， and the DEHP+H-FA group had a significant increase in the protein expression level of CYP7A1 （P<0.05）. Conclusion Folic acid has a protective effect against cholestatic liver injury in mice induced by DEHP exposure， possibly by regulating bile acid synthesis， catabolism， and transport and maintaining bile acid homeostasis. -
Key words:
- Di-（2-Ethylhexyl） Phthalate /
- Folic Acid /
- Cholestasis /
- Bile Acid
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胆汁淤积是由于胆汁生成、分泌和排泄障碍而引起的一种病理过程，表现为肝脏及体循环内胆汁酸的蓄积。长时间的胆汁淤积可导致严重的肝胆损伤、炎症、纤维化甚至肝硬化。多种因素可导致胆汁淤积，包括遗传、免疫、药物和环境等。邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯［di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP］作为最常用的增塑剂被广泛用于医疗器械、食品包装、化妆品等方面。既往研究［1］报道，静脉输液器等医疗产品中DEHP的浸出会增加胆汁淤积的发生风险。本课题组前期研究［2］已证实DEHP暴露可导致小鼠发生胆汁淤积。目前临床治疗胆汁淤积的药物主要有熊去氧胆酸、奥贝胆酸、S-腺苷蛋氨酸等，但其疗效有限，亟需寻找新的治疗药物。
叶酸作为人体必需的B族水溶性维生素，在维持一碳单位代谢、细胞生长和繁殖等过程均发挥重要作用。大量研究［3-6］表明，叶酸可通过抗炎、抗氧化应激、调节肠道菌群和糖脂代谢等对酒精、高脂饮食、药物所致的肝损伤发挥保护作用。然而叶酸对胆汁淤积型肝损伤是否具有保护作用尚未见报道。基于此，本文采用DEHP诱导小鼠胆汁淤积模型，探究叶酸对小鼠胆汁淤积的保护作用及其机制，以期为叶酸的临床应用提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
30只健康雌性 ICR小鼠，8周龄，SPF级，体质量为28～30 g，购买于北京斯贝福生物技术有限公司。实验动物生产许可证编号：SCXK（京）2019-0010，实验动物使用许可证编号：SYXK（皖）2020-001。小鼠饲养在适宜的环境中：温度维持在（25±1）℃，湿度维持在55%±5%，自由饮水和摄食。
1.1.2 主要试剂
总胆汁酸（TBA）试剂盒和碱性磷酸酶（ALP）购自浙江伊利康生物技术有限公司（货号：L70021、L70042）；叶酸与DEHP购自美国默克公司（货号：F7876、D201154-500 mL）；22种胆汁酸标准品购自美国默克公司、中国上海源叶生物科技有限公司和美国Avanti®Polar Lipids公司；玉米油购自上海阿拉丁生化有限公司（货号：C116025-500 mL）；超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒和丙二醛（MDA）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所（货号：A001-3-2、A003-1-2）；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、RIPA裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）购自碧云天生物技术公司（货号：P0028、P0013B、P0010）；FXR、CYP7A1和MRP2抗体购自Abcam公司（货号：ab51970、ab65596、ab203397）；CYP3A11购自圣克鲁斯生物有限公司（货号：sc-271033）； GAPDH和H3抗体购买于Abmart公司（货号：P60037、P30266F）。
1.1.3 主要仪器
纯水仪（型号：Direct-Q3UV）购自美国Millipore公司；多功能酶标仪（型号：ELx808）购自美国BioTek公司；全自动生化分析仪（型号：CS-T300）购自长春迪瑞医疗科技股份有限公司；台式高速离心机（型号：D37520）购自赛默飞世尔科技公司；三重四级杆串联质谱仪（型号：AB Sciex Triple Quad 4500）购自美国AB公司；显影仪（型号：Tanon-5200Multi）购自上海天能科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与处理
适应性喂养7天后进行实验操作。将所有小鼠按照体质量S型分为对照（Control）组、叶酸高剂量（H-FA）组、DEHP组、DEHP+叶酸低剂量（DEHP+L-FA）组、DEHP+叶酸高剂量（DEHP+H-FA）组，每组6只。叶酸低剂量和高剂量分别为1 mg/kg、5 mg/kg。H-FA组、DEHP+L-FA组和DEHP+H-FA组给予相应剂量的叶酸灌胃，Control组和DEHP组灌胃等量的PBS溶液。2 h后，DEHP组、DEHP+L-FA组和DEHP+H-FA组给予含200 mg/kg DEHP的玉米油，Control组和H-FA组灌胃等量的纯玉米油，共灌胃4周。取材前禁食6 h，收集血液和肝组织用于后续实验。
1.2.2 一般情况观察
每天观察小鼠的精神、毛发及死亡情况，记录体质量与摄食量。
1.2.3 肝组织病理学观察
将小鼠肝大叶相同部位组织经4%多聚甲醛浸泡处理，室温放置摇床固定24 h后，脱水、包埋、切片、固定和苏木精-伊红（HE）染色后，显微镜下观察并拍照。
1.2.4 血清生化检测
使用生化分析仪检测血清中TBA和ALP的含量。
1.2.5 小鼠肝组织中MDA和SOD含量的测定
准确称取组织重量，按照重量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水制备匀浆，离心取上清液待测。根据试剂盒说明书步骤进行相关操作，检测小鼠肝组织匀浆中MDA和SOD的含量。
1.2.6 液相色谱-三重四级杆质谱检测血清胆汁酸谱
采用液相色谱-三重四级杆质谱仪（AB SCIEX Triple Quad™ 4500 System）检测小鼠血清中各胆汁酸组分水平。色谱柱：Phenomenex Gemini 3um NX-C18 110A （100 mm×2.0 mm）；流动相：A相为含有0.1%冰乙酸的4 mmol/L乙酸铵溶液，B相为甲醇；柱温为40 ℃；流速为0.4 mL/min；进样量为10 μL。
1.2.7 Western Blot检测小鼠肝组织胆汁酸代谢相关蛋白
称取小鼠肝组织50 mg，用RIPA裂解液提取总蛋白，并用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒提取核蛋白，用BCA法测定蛋白浓度并进行定量。蛋白经SDS-PAGE电泳分离，并转移到PVDF膜上，用快速封闭液封闭30 min，FXR（1∶2 500）、CYP7A1（1∶1 000）、CYP3A11（1∶1 000）、MRP2（1∶1 000）、H3（1∶10 000）、GAPDH（1∶5 000）一抗置于4 ℃冰箱孵育过夜，再用相应二抗（1∶10 000）室温孵育1～2 h。用超敏ECL化学发光试剂盒在显影仪上显影，用 Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算蛋白表达量。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0软件进行数据分析，计量资料以
2. 结果
2.1 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠体质量和摄食量的影响
5组小鼠初始体质量差异无统计学意义（P值均>0.05）。从第10天开始，DEHP组小鼠的体质量明显低于对照组（P值均<0.05）；与DEHP组相比，DEHP+L-FA组与DEHP+H-FA组小鼠的体质量差异无统计学意义（P值均>0.05）。与对照组相比，DEHP组的每日摄食量显著降低（P<0.01）；与DEHP组相比，DEHP+L-FA组与DEHP+H-FA组小鼠的摄食量差异均无统计学意义（P值均>0.05）（图1）。
2.2 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠肝功能的影响
与对照组相比，DEHP组小鼠肝质量指数显著增加（P<0.01）；与DEHP组相比，DEHP+L-FA组与DEHP+H-FA组小鼠肝质量指数均明显降低（P值均<0.01）。血清生化指标表明，与对照组相比，DEHP组小鼠血清TBA和ALP均显著升高（P<0.01、P<0.05）；相较于DEHP组，DEHP+H-FA组小鼠血清TBA和ALP均明显降低（P<0.01、P<0.05），DEHP+L-FA组小鼠血清TBA和ALP差异均无统计学意义（P值均>0.05）（图2）。HE染色结果显示，对照组与H-FA组的肝组织结构完整，DEHP组小鼠肝组织中可见汇管区扩大，胆管变形和增生并伴有少量炎性细胞浸润，而叶酸干预后可显著改善小鼠肝组织形态结构（图3）。以上结果表明叶酸对DEHP暴露诱导的胆汁淤积型肝损伤有明显保护作用。
图 2 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠肝功能的影响Figure 2. Effects of folic acid on liver function in DEHP-induced cholestasis mice2.3 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠肝组织MDA、SOD含量的影响
相比于对照组，DEHP组的MDA含量显著上升（P<0.01），SOD含量显著下降（P<0.05）；与DEHP组相比，MDA和SOD含量在DEHP+H-FA组显著回调（P值均<0.05），DEHP+L-FA组差异无统计学意义（P值均>0.05）（图4）。提示在DEHP诱导的胆汁淤积型肝损伤中存在氧化应激，而叶酸能通过增强机体抗氧化发挥保肝作用。
图 4 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠氧化应激的影响Figure 4. Effects of folic acid on oxidative stress in DEHP-induced cholestasis mice2.4 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠血清胆汁酸含量的影响
采用LC-MS/MS检测小鼠血清中各胆汁酸组分，探究DEHP暴露以及叶酸干预对小鼠血清各胆汁酸组分的作用。小鼠血清胆汁酸以游离型和牛磺酸结合型为主，甘氨胆酸、鹅脱氧甘胆酸等5种甘氨酸结合型胆汁酸因含量低于检测限而无法定量。与对照组相比，DEHP组小鼠血清中TBA、未结合型胆汁酸、初级胆汁酸、次级胆汁酸均不同程度升高（P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05）；而高剂量叶酸干预后，血清中TBA、未结合型胆汁酸、初级胆汁酸、次级胆汁酸基本降低至正常水平（P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05）。对血清中每种胆汁酸成分的含量进行分析，结果显示，与对照组相比，DEHP组小鼠血清中有7种结合型胆汁酸［牛磺胆酸（TCA）、牛磺去氧胆酸（TDCA）、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）、牛磺-β-鼠胆酸（T-β-MCA）、牛磺-α-鼠胆酸（T-α-MCA）、牛磺猪去氧胆酸（THDCA）、牛磺石胆酸（TLCA）明显升高］和5种未结合型胆汁酸［熊去氧胆酸（UDCA）明显降低，α-鼠胆酸（α-MCA）、β-鼠胆酸（β-MCA）、去氧胆酸（DCA）、石胆酸（LCA）明显升高］均有显著变化（P值均<0.05）；而高剂量叶酸干预后，除α-MCA、β-MCA外，其余胆汁酸均显著回调（P值均<0.05）。聚类热图分析5组间各胆汁酸亚型的分布规律，结果显示，组内聚类理想，差异胆汁酸在不同组间区别明显（图5）。结果表明叶酸可显著改善DEHP暴露导致的小鼠血清胆汁酸组分紊乱。
图 5 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠血清胆汁酸谱的影响Figure 5. Effects of folic acid on bile acid profile in DEHP-induced cholestasis mice2.5 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠胆汁酸代谢相关蛋白表达的影响
为了进一步探究DEHP暴露及叶酸干预对小鼠肝组织胆汁酸代谢相关蛋白的作用，采用Western Blot法检测小鼠肝脏胆汁酸代谢主要核受体FXR、胆汁酸合成酶CYP7A1、胆汁酸代谢酶CYP3A11、胆汁酸排泌转运体MRP2等相关蛋白的表达水平。与对照组相比，DEHP组FXR和CYP3A11蛋白表达水平均明显增加（P值均<0.01），CYP7A1和MRP2蛋白表达水平均显著降低（P值均<0.01）。与DEHP组相比，FXR和CYP3A11在DEHP+L-FA组和DEHP+H-FA组中均明显下调（P值均<0.05）；MRP2在DEHP+L-FA组和DEHP+H-FA组中均显著上调（P值均<0.05）；CYP7A1在DEHP+H-FA组中显著上调（P<0.05）（图6）。
图 6 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠胆汁酸代谢相关蛋白表达的影响Figure 6. Effects of folic acid on the expression of proteins related to bile acid metabolism in DEHP-induced cholestatic mice3. 讨论
DEHP作为用量最大的邻苯二甲酸酯类增塑剂，可通过消化道、呼吸道、皮肤等途径进入人体。这种内分泌干扰物在体内的蓄积能诱发生殖毒性、神经毒性、肝脏毒性及致癌性［7］。肝脏作为DEHP代谢的主要靶器官，体内外实验结果［8-9］表明，DEHP暴露可加重氧化应激和炎症，影响肝脏糖脂代谢并促进胆汁淤积和纤维化进展。ALP是胆汁淤积型肝病早期最具特征性的表现，且增高程度与胆管阻塞的程度正相关。血清TBA是胆汁淤积型肝病最主要的实验室证据支持。在本研究中，DEHP组小鼠肝体比、血清ALP和TBA明显升高，肝脏病理可见汇管区扩大，胆管变形和增生并伴有少量炎性细胞浸润，提示胆汁淤积模型造模成功。叶酸干预后，小鼠肝体比、血清生化指标TBA和ALP明显下降，肝脏病理显著改善，表明叶酸能有效保护DEHP诱导的胆汁淤积型肝损伤。MDA和SOD是评价机体氧化应激常用的两个指标。本研究通过对肝脏MDA和SOD的检测，说明DEHP暴露可导致小鼠氧化应激的增加，而氧化应激会进一步推进胆汁淤积性肝病的进程，提示叶酸能通过提高机体抗氧化能力起到保肝作用。
为了探究DEHP暴露及叶酸干预对胆汁酸谱的影响，基于液相色谱串联质谱法对小鼠血清中17种胆汁酸进行绝对定量分析，发现模型组升高的多为结合胆汁酸，其中TCA升高最为明显。在对照组中，TCA约占总胆汁酸15%，在DEHP组中则升高至39%，这一现象也存在于胆汁淤积型肝硬化患者及胆管结扎、α-异硫氰酸酯等胆汁淤积动物模型中［10-12］。胆汁酸作为一种两性分子，其肝脏毒性的大小受疏水性的影响。本实验结果中，LCA、DCA、CDCA、CA等疏水性胆汁酸均不同程度升高，其中肝毒性最强的胆汁酸LCA升高最显著。叶酸给药后，这些胆汁酸均表现出下降趋势，表明其有效干预胆汁酸成分紊乱，降低毒性胆汁酸的浓度以保护肝损伤。胆汁淤积时，体内蓄积的胆汁酸通过肠肝循环影响肠道菌群稳态，而肠道菌群又会反过来影响胆汁酸的组成与疏水性［13］。肝脏中生成的初级胆汁酸大部分以牛磺酸和甘氨酸结合型分泌入胆汁，排入肠道后在胆盐水解酶和7α-脱羟基酶的作用下生成次级胆汁酸和未结合型胆汁酸。本研究中，DEHP组结合型胆汁酸增加的比例远高于未结合型胆汁酸，尤其是T-β-MCA、T-α-MCA和TUDCA增加而β-MCA、α-MCA和UDCA降低，造成这一结果的原因可能是肠道菌群胆盐水解酶活性的下降，导致胆汁酸的解偶联能力降低。而胆汁酸解偶联能力的降低又会进一步导致肠肝循环中胆汁酸的排泄下降，体内胆汁酸增加。以上结果提示肠道微生态失衡可能参与了DEHP诱导的胆汁淤积，未来可进一步研究其在叶酸改善DEHP诱导的胆汁酸代谢紊乱中的作用。
胆汁淤积发生时毒性胆汁酸的蓄积会造成肝损伤，从而激发肝脏产生适应性反应。FXR作为细胞核激素受体超家族之一，可被胆汁酸激活，是胆汁酸代谢的主要调节剂［14］。一般而言，胆汁酸疏水性越强，其对FXR的亲和力就越高。将本次测定的胆汁酸按照激活强度排序，依次为CDCA>TCA>DCA>LCA。激活FXR可通过抑制CYP7A1而减少胆汁酸合成，也可通过诱导CYP3A11而增加胆汁酸代谢。在本研究中，与对照组相比，DEHP组FXR和CYP3A11蛋白表达水平明显增加，CYP7A1蛋白表达水平显著降低，提示DEHP暴露28天可导致小鼠出现胆汁淤积状态，但由于肝脏强大的代偿功能，一定程度上保护了毒性胆汁酸造成的肝损伤。值得注意的是，DEHP组MRP2蛋白表达水平下降，而叶酸干预能逆转MRP2蛋白的表达水平。MRP2是位于肝细胞毛细胆管膜的胆汁酸转运蛋白，主要负责排泌胆汁酸和结合胆红素等有机阴离子化合物，在维持胆汁酸稳态和肠肝循环起到重要作用。大量研究［15-20］表明，在雌激素、胆管结扎、α-异硫氰酸酯、脂多糖等多种胆汁淤积模型、丙型肝炎及梗阻性胆汁淤积患者体内，均发现了MRP2蛋白表达的下降。这与本研究结果一致，MRP2的下调加重了胆汁淤积小鼠胆汁酸的蓄积。
综上所述，叶酸可能通过调控胆汁酸合成、代谢与转运，维持胆汁酸代谢稳态，并通过提高机体抗氧化能力，从而对DEHP诱导的胆汁淤积型肝损伤产生保护作用。
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图 2 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠肝功能的影响
Figure 2. Effects of folic acid on liver function in DEHP-induced cholestasis mice
图 4 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠氧化应激的影响
Figure 4. Effects of folic acid on oxidative stress in DEHP-induced cholestasis mice
图 5 叶酸对DEHP诱导的胆汁淤积小鼠血清胆汁酸谱的影响
Figure 5. Effects of folic acid on bile acid profile in DEHP-induced cholestasis mice
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