结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种全球死亡率排第二的常见消化道恶性肿瘤^［1］。目前，免疫治疗应用于恶性实体瘤已经成为一种新兴并有持续发展潜力的治疗方式^［2］，程序性死亡受体1（PD-1）抑制剂应用于高突变负荷的错配修复缺陷（MMRd）或者微卫星不稳定（MSI）的CRC患者中虽然已经取得了相对较好的治疗效果，但MMRd/MSI-H的CRC患者总体反应率只有30%～55%^［3］，仍有较大部分患者对免疫治疗不敏感，目前对CRC免疫治疗反应性的预测因素也知之甚少。肿瘤发生转移是CRC患者死亡的主要原因，其中肝脏是CRC最常见的远处转移器官，而发生肝转移主要是通过血源性转移的方式，肿瘤微环境（TME）中肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast，CAF）可以通过促进肿瘤血管生成来促使CRC发生血源性转移^［4］，此外，CAF还可以通过分泌多种生长因子和细胞因子促进肿瘤的发生以及转移，或者分泌趋化因子使一些具有免疫抑制功能的髓系细胞趋化到TME中来抑制免疫应答，CAF还可以通过重塑细胞外基质，形成一道屏障来阻止免疫细胞或者药物向肿瘤组织的渗透，从而形成治疗抵抗以及产生耐药性^［5-7］。因此，CAF可以作为肿瘤相关治疗的一个关键的靶点，但CAF群体具有高度异质性，一些亚群在肿瘤生长中也可以发挥抑制作用^［8］，这就要求靶向CAF亚群必须更加精确。近年来，随着单细胞测序的发展，CAF亚群的异质性也在逐渐被揭露。但是这些异质性的CAF亚群在促进肿瘤转移过程以及免疫治疗过程中的具体作用机制尚不清楚。据此，本研究具体探究了CRC患者中关键CAF亚群的特点以及在免疫治疗过程中的变化，同时探究了其在肝转移过程中的作用，并进一步通过配受体相互作用分析与体外实验证明了NRG1-ERBB3信号通路在促进肿瘤转移和侵袭中的重要作用，为深入了解CRC发生发展及转移过程中关键性的致病CAF亚群及关键信号通路提供线索。

1.   材料与方法

1.1   数据集下载

在美国国家生物技术信息中心（NCBI）的基因表达数据库（GEO）^［9］下载Li等^［10］的CRC单细胞测序数据集GSE205506以及CRC肝转移患者的RNA测序数据集GSE49355、GSE50760、GSE81558和GSE68468，其中单细胞数据集包括19个经过PD-1免疫治疗的MMRd型CRC患者的40个样本，其中免疫治疗完全缓解定义为切除的原发肿瘤样本和所有取样的区域淋巴结中没有任何存活肿瘤细胞^［10］。生存分析所用的TCGA_COAD肠癌数据库（portal.gdc.cancer.gov/）中共包含369例患者的临床信息。

1.2   可视化分析

通过seurat包（版本4.2.1）的Read10X函数进行数据读取并整合后转变成seurat对象，保留的细胞设定为检测到的有效基因数目即nFeatureRNA的阈值为小于5 000且大于200，nCount_RNA阈值为小于30 000，并在创建Seurat对象时设置min.cells参数等于10，即保留的基因为至少在10个细胞中有表达的基因，线粒体的过滤阈值为50%，样本合并采用merge函数，标准化采用NormalizeData函数并设置其他参数为函数默认值，去批次采用RunHarmony函数，聚类分群采用前20个维度即设置dims参数为1∶20，resolution设定为0.6，经筛选后保留肿瘤组织中4 549个成纤维细胞及其17 546个基因进行umap可视化分析。根据可视化图及其特征基因，将成纤维细胞亚群进行命名，并计算出免疫治疗前后每种成纤维细胞亚群的占比，用graphpad软件进行统计。

1.3   差异基因和通路富集分析

差异基因通过Seurat包中FindMarkers函数进行分析，其min.pct参数设置为0.1，其余参数均使用默认值，差异检验算法采用Wilcoxon检验。差异基因的分布情况基于差异表达倍数与P值进行火山图展示。通路富集差异分析使用GSVA包（版本号1.44.5）进行分析，简单来说，通过对每个成纤维细胞使用gsva函数进行hallmark基因集（MsigDB数据库下载）的富集评分计算，评分算法采用“ssgsea”。随后对每个成纤维细胞亚群与其他所有亚群间的通路评分使用limma包（版本号3.52.4）进行差异分析，并通过热图展示存在明显差异的基因集。

1.4   生存分析

从TCGA数据库中下载CRC患者的临床信息和表达阵列数据，生存曲线使用R包survival（版本号3.4.0）与survminer（版本号0.4.9）进行绘制，采用Log-rank检验计算生存率。其中患者F6_MMP1亚群评分计算先通过FindMarker函数计算出该亚群特异性高表达的基因集，再使用gsva函数利用该基因集对每个患者进行富集评分。生存曲线的分组阈值则基于基因的表达值或者gsva通路富集评分高低使用maxstat包中“maxstat.test”函数进行自动寻找，以使得两组间差异最大（其中每组至少包括20%以上的患者数量）。

1.5   成纤维细胞亚群与肿瘤细胞间相互作用分析

使用CellPhoneDB软件分析每个成纤维细胞亚群与肿瘤细胞间的相互作用，并基于计算得到的P值与相互作用平均值进行气泡图展示。

1.6   亚群基因评分及比例分析

使用Seurat包中的FindMarkers函数计算出F6_MMP1亚群特异性高表达基因，选取前100个基因使用gsva函数算出RNA测序数据中每个样本分数作为F6_MMP1亚群的评分；比例计算采用FindAllMarkers函数计算出每个亚群相对于其他所有亚群的特异性上调基因，提取出原始表达矩阵中所有细胞这些差异上调基因的表达值数据，上传至CIBERSORTx在线工具进行参考数据库的构建，随后利用创建的参考数据库计算出导入的RNA测序数据库各个样品中每种CAF的相对比例。

1.7   体外探究NRG1对肿瘤细胞迁移与侵袭的影响

（1）迁移实验：选取孔径8 μm的小室（BD Biosciences），将5×10⁴结直肠癌细胞株CACO2接种在小室上层含2% FBS的200 μL DMEM培养基中，小室下层加入600 μL DMEM完全培养基，实验组中加入50 ng/mL的rNRG11（396-HB-050，R & D systems），每次实验每组设置3个副孔，24 h后，PBS清洗小室，甲醛固定10 min，用棉签擦掉小室上层残留的细胞，迁移到小室下层的细胞结晶紫染色后置于显微镜下拍照，选取上下左右中5个视野各拍一张，取平均数进行统计。（2）侵袭实验：在小室上层聚碳酸酯膜上铺一层基质胶（康宁356234，1∶6稀释），置于37 ℃培养箱凝固2 h后加PBS水化15 min，将1×10⁵个细胞接种到含2% FBS的DMEM培养基的小室上层，48 h后染色，其他实验条件同迁移实验，置于显微镜下拍照。（3）划痕实验：将肿瘤细胞接种在六孔板中，当细胞长满六孔板时，用200 μL枪头在细胞表面划痕，用1×PBS清洗掉细胞碎片，加入含2% FBS的DMEM培养基，分别设置加入0 ng/mL NRG1，5 μmol/mL ERBB3抗体（HY-P99268），50 ng/mL NRG1，5 μmol/mL ERBB3抗体+ 50 ng/mL NRG1四组，显微镜拍照记录0 h和24 h时相同划痕位置的划痕面积。

1.8   统计学方法

采用raphPad Prism 8和R软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料用x¯±s表示，两组间比较采用成组t检验，三组间的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey检验。应用Kaplan-Meier绘制生存曲线，采用Log-rank检验比较生存率。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   F6_MMP1⁺CAF影响免疫治疗的效果

为了探究PD-1免疫治疗前后肿瘤微环境中成纤维细胞亚群的变化，进而挖掘出可能影响免疫治疗的关键CAF亚群，将CRC患者单细胞测序数据中经筛选过的4 549个成纤维细胞进行总体降维以及免疫治疗前后分别进行降维（图1a、b），可以将CAF分成7个亚群，并根据每个亚群的标志性基因对每群细胞进行命名（图1c）。由统计图（图1d）可以看出，经过免疫治疗后F1_MYH11比例明显升高（P<0.01），F6_MMP1比例明显降低（P<0.01），说明免疫治疗会影响肿瘤微环境中CAF亚群的组成。此外，进一步分析发现，免疫治疗后完全缓解患者肿瘤中F6_MMP1比例明显降低（P<0.001），而免疫治疗后未完全缓解患者中未能看到其比例的降低（P=0.73）（图1e），说明F6_MMP1可能在免疫治疗过程中产生一定的作用进而影响免疫治疗是否能够完全缓解，F6_MMP1⁺CAF可以作为PD-1免疫治疗效果的预测靶标。

注： a，CRC成纤维细胞降维图； b，PD-1免疫治疗前后CAF亚群降维图；c，各亚群标志性基因展示；d，PD-1免疫治疗前后各CAF亚群所占比例；e，未治疗和治疗后完全缓解以及不完全缓解组中各CAF亚群所占比例。

图  1  F6_MMP1⁺CAF影响免疫治疗的效果

Figure  1.  F6_MMP1⁺CAFs influence response to immunotherapy

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2.2   F6_MMP1⁺CAF与患者预后不良及肿瘤发展有关

为了进一步探究F6_MMP1的功能，通过差异基因分析发现，F6_MMP1高表达促进肿瘤转移和侵袭的基质金属蛋白酶（MMP）相关基因^［11］，高表达WNT5A基因可以增强肿瘤细胞干性和促进血管生成^［12-13］，另外也高表达与肿瘤预后不良相关的INHBA基因^［14］等（图2a）。将F6_MMP1高表达的基因用TCGA数据库对CRC患者进行生存分析，发现高表达MMP1、MMP3和WNT5A的CRC患者总体生存率更差（图2b），此外，根据F6_MMP1的特征基因集对CRC患者进行评分发现，F6_MMP1评分高的CRC患者的总体生存率更差（图2b）。为了进一步揭示CAF亚群与肿瘤细胞之间的相互作用关系，通过细胞配受体相互作用分析发现，F6_MMP1主要通过NRG1和肿瘤细胞表面的ERBB3受体相互作用（图2c），对CAF亚群的基因进行通路富集分析发现，F6_MMP1缺氧相关信号通路明显上调，在适应缺氧TME的过程中，肿瘤细胞可以获得更强的侵袭和转移性以及对治疗产生抵抗^［15-16］。另外，IL-6-JAK-STAT3信号通路也明显上调，CRC中CAF分泌的IL-6介导的信号转导和STAT3激活可以促进CRC的转移^［17］。此外，在血管生成、上皮向间充质转化（EMT）、糖酵解、TGF-β和NF-κB等信号通路也明显升高（图2d），这进一步说明F6_MMP1在CRC发生和转移过程中可能发挥着重要的促进作用，或许可以作为一种针对性治疗的关键靶细胞。

注： a，火山图展示F6_MMP1⁺CAF和其他CAF差异基因；b，CRC患者中表达MMP1、MMP3、WNT5A基因评分高低与患者总体生存率的关系；c，各CAF亚群与肿瘤细胞配受体相互作用分析；d，各CAF亚群基因通路富集展示。

图  2  F6_MMP1⁺CAF与患者预后不良及肿瘤发展有关

Figure  2.  F6_MMP1⁺CAFs are associated with poor prognosis and tumor progression

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2.3   F6_MMP1⁺CAF可能与CRC发生肝转移过程密切相关

在F6_MMP1高表达的基因中，大多都与肿瘤转移相关，主要包括促进肿瘤转移相关的趋化因子CXCL5、CXCL8和CXCL3，与基质降解相关的基因MMP1和MMP3，以及促进肿瘤生长和远端转移相关的细胞因子NRG1、HGF和AREG等（图3a）。肝脏作为CRC发生远端转移的主要部位，进一步探究了发生CRC肝转移的患者原发灶肿瘤发生过程中F6_MMP1的变化，发现和正常组织相比，CRC肝转移的患者肿瘤组织中F6_MMP1的评分和比例明显升高（P<0.001）（图3b～d），这说明F6_MMP1可能在肿瘤的发生以及肝转移过程中发挥着重要的促进作用。

注： a，F6_MMP1高表达基因展示图；b，RNA测序数据库GSE49355中CRC肝转移患者肠道正常组织和原发灶肿瘤组织中F6_MMP1评分和比例配对统计，CLMN：CRC肝转移患者肠道正常组织，CLMT：CRC肝转移患者肠道肿瘤组织；c，RNA测序数据库GSE50760中CRC肝转移患者正常组织和原发灶肿瘤组织中F6_MMP1评分和比例配对统计；d，RNA测序数据库GSE81558和GSE68468中CRC肝转移患者正常组织和原发灶肿瘤组织中F6_MMP1评分统计。

图  3  F6_MMP1⁺CAF可能与CRC发生肝转移过程密切相关

Figure  3.  F6_MMP1⁺CAFs may be related to the liver metastasis of CRC

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2.4   F6_MMP1⁺CAF表达的NRG1激活ERBB通路促进CRC的迁移和侵袭

F6_MMP1与肿瘤细胞之间主要通过NRG1-ERBB3进行相互作用（图2c）。体外实验证明，NRG1可以促进CRC细胞发生迁移和侵袭（P<0.001，P<0.05）（图4a、b），用ERBB3阻断抗体处理CRC细胞后，NRG1对CRC细胞的促迁移作用明显减弱甚至消失（P<0.01）（图4c、d），这进一步说明NRG1通过与肿瘤细胞表面的ERBB3受体作用来激活ERBB信号通路促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。

注： a、b，Transwell实验证明NRG1对CACO2迁移和侵袭能力的影响（×40）；c、d，划痕实验证明NRG1通过结合ERBB3发挥作用。

图  4  F6_MMP1⁺CAF表达的NRG1激活ERBB通路促进CRC的迁移和侵袭

Figure  4.  NRG1 expressed by F6_MMP1⁺CAFs activates ERBBs pathway and promotes CRC migration and invasion

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3.   讨论

由于CRC发病隐匿，初次就诊的患者近30%发现肿瘤转移，发生转移的CRC患者中45%～60%会发生肝转移，充分了解肿瘤发生发展以及治疗过程中TME中的变化对于挖掘关键致病细胞以及优化治疗方案具有重要作用。CAF是TME中的重要组成部分，对重塑肿瘤细胞外基质，促进肿瘤血管生长发生血源性转移以及诱导耐药和形成免疫抑制的微环境发挥重要作用^［18-19］，本研究主要关注了MMRd的CRC患者在PD-1免疫治疗前后，TME中CAF亚群的动态变化，发现了F6_MMP1在免疫治疗后显著减少，但减少只发生在对PD-1免疫治疗能够完全缓解的患者中。另外发现，F6_MMP1特异性高表达肿瘤侵袭和转移特征基因NRG1、CXCL5、CXCL3、CXCL8、IL-6、IL-1β以及MMP等，有研究表明，CXCL5的高表达与患者肿瘤发生侵袭和转移密切相关，并且CXCL5的高表达是促进CRC向肝脏转移的有利因素^［20-22］，TME中CXCL3和CXCL8的高表达也与促进肿瘤发生转移相关^［23-24］，MMP1和MMP3可以促进基质降解从而破坏肿瘤侵袭的基质屏障来促进肿瘤的转移，CAF分泌的IL-6是免疫检查点阻断治疗的关键抑制因子^［25-26］，而IL-1β抑制肿瘤细胞铁死亡来介导免疫治疗抵抗^［27］。此外，CAF来源的NRG1、HGF和AREG也对肿瘤的生长、耐药和远端转移等过程发挥重要作用^［28-30］。在功能通路富集分析中发现，F6_MMP1上调NF-κB、TGF-β、低氧、糖酵解、血管生成以及EMT等与肿瘤进展相关的信号通路，这提示F6_MMP1或许是CRC进展中的一群关键致病细胞。

近年来，其他肿瘤中研究过的关键致病CAF亚群的表型以及功能与发现的F6_MMP1具有一些相似的特点，但也有一些不同之处。一项前列腺癌的研究^［28］表明，CAF通过分泌NRG1来激活前列腺癌细胞中的HER3信号传导，从而促进前列腺癌的抗雄激素抵抗。本研究结果发现，CRC中F6_MMP1可能通过NRG1的分泌激活肿瘤细胞表面的ERBB3信号通路从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。在鳞状细胞癌研究^［31］中，分泌IL-1β、IL-6和CXCL1的促炎性CAF依赖IL-1β触发的NF-κB通路激活招募巨噬细胞到TME中，促进肿瘤炎症和血管生成。本研究中F6_MMP1同样高表达IL-1β、IL-6和CXCL1，并在NF-κB等通路有明显的上调，这说明F6_MMP1可能也存在于其他癌症中，但在不同癌症中具有功能的异质性，或者说F6_MMP1的功能可能是多样化的，可以通过多种复杂的机制来促进疾病的进一步发展，值得进行深入探究。

CAF已经逐渐成为免疫治疗过程中的一个关键靶细胞。胰腺癌相关研究^［26］表明，αSMA⁺CAF产生的IL-6可能是胰腺癌中免疫检查点阻断治疗的关键抑制因子，敲除αSMA⁺CAF的IL-6可以提高PD-1治疗的效果，显著提高胰腺癌小鼠的存活率。在CRC中的研究^［32］表明，FAP⁺成纤维细胞和SPP1⁺巨噬细胞在肿瘤组织中富集有助于增强对PD-L1阻断免疫治疗的耐药性，破坏两者的相互作用有望用来改善免疫治疗。但目前在CRC中CAF影响免疫治疗效果并促进肿瘤转移的潜在机制还未有明确的报道，这也进一步导致了部分患者常用的PD-1免疫阻断治疗效果不好的原因不明，并且没有明确的预测靶点，本研究提示F6_MMP1或许可以作为一个PD-1免疫治疗效果是否良好的预测指标。

综上所述，本研究通过数据库挖掘和实验验证F6_MMP1在CRC患者PD-1免疫治疗以及转移过程中发挥重要作用，并结合临床CRC相关数据验证了这一点。本研究发现，F6_MMP1不仅在促进CRC的转移尤其是肝转移过程中发挥重要作用，还可能对CRC的PD-1阻断治疗发挥作用，因此，F6_MMP1可以作为CRC预后以及免疫治疗效果的预测靶点。F6_MMP1表型及功能特点为进一步了解CRC的转移机制以及影响免疫治疗效果的因素提供了新的思路，未来需要进一步实验以及临床相关研究来验证此发现，或许将来可以作为疾病治疗的关键靶细胞。

本研究还存在以下几点不足：（1）肠道CAF亚群的分类可能和样本的分离、测序深度以及患者的个体差异性有较大的联系，虽然本篇文章所用MMRd的CRC单细胞测序数据样本数目较多且临床信息比较全面，若要寻找F6_MMP1⁺CAF在CRC患者中是否普遍存在且功能是否一致，还需要在多个数据集中进行进一步验证。（2）本研究中关于F6_MMP1⁺CAF对CRC发生转移尤其是肝转移的作用还需要更多的实验来进一步证明和发掘其中的作用机制。（3）尽管发现了F6_MMP1⁺CAF在免疫治疗过程中比例发生变化，但其影响免疫治疗的具体机制还需要进一步体内以及临床试验进行探究。