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2型糖尿病胰腺癌裸鼠模型的建立及活体成像观察
DOI: 10.12449/JCH240625
Establishment and in vivo imaging observation of a nude mouse model of type 2 diabetes mellitus and pancreatic cancer
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摘要:
目的 建立可动态观察成瘤过程并进行体内研究的2型糖尿病（T2DM）胰腺癌裸鼠模型。 方法 首先，通过慢病毒载体GV260转染人胰腺癌细胞（PANC-1细胞）构建能稳定表达萤火虫荧光素酶的胰腺癌细胞株（PANC-1-Luc细胞）。然后，将36只SPF级裸鼠随机分为对照组（n=12，血糖正常的胰腺癌裸鼠）和模型组（n=24，T2DM胰腺癌裸鼠）。对照组：先给予繁殖饲料喂养，之后将PANC-1-Luc细胞异位种植于裸鼠皮下；模型组：先给予高脂饲料喂养联合腹腔注射1% STZ，之后将PANC-1-Luc细胞异位种植于裸鼠皮下。用荧光活体成像系统和人工测量法同步动态监测2组裸鼠胰腺癌生长情况，绘制肿瘤生长曲线、分析荧光值与肿瘤体积的关系。显微镜下观察裸鼠皮下肿瘤及胰岛，验证造模是否成功；同时，通过免疫组化检测肿瘤组织Ki-67的表达来分析高血糖对裸鼠胰腺癌生长的影响。正态分布计量资料组间比较采用成组t检验，非正态分布计量资料组间比较采用Mann-Whitney U检验。 结果 确定PANC-1细胞慢病毒载体稳定转染的最佳病毒滴度为5×107 TU/mL，用嘌呤霉素筛选的最佳浓度为20 μg/mL、最佳筛选时间为9天；PANC-1-Luc细胞的荧光值与细胞数量呈线性正相关，线性方程为y=42.56x－42 504（r=0.977，P=0.004）。T2DM裸鼠模型血糖值为23.05（19.25～26.40）mmol/L，且每只裸鼠的血糖均高于11.1 mmol/L，与对照组裸鼠血糖值［6.15（5.20～7.30）mmol/L］相比，差异有统计学意义（Z=-8.45，P<0.001）。与对照组相比，模型组胰腺组织内胰岛数量减少、体积减小、形状不规则、边界模糊，同时移植瘤病理学检查确认镜下为胰腺癌组织，可判定T2DM裸鼠胰腺癌模型造模成功。模型组皮下肿瘤大小与荧光值呈线性正相关，线性方程为y=232 348 691x－8 258 608（r=0.911，P=0.031）；模型组移植瘤Ki-67免疫组化阳性率显著高于对照组［（50.333±7.808）% vs （15.917±4.055）%，t=13.55，P<0.001］，说明模型组肿瘤增殖较快。 结论 本研究所构建的T2DM裸鼠胰腺癌模型可模拟T2DM背景下胰腺癌发生、发展的病理过程，动态观察高血糖对体内胰腺癌细胞生长的影响，从而为T2DM背景下胰腺癌发生、发展的体内研究提供新的实验载体。 Abstract:Objective To establish a nude mouse model of type 2 diabetes mellitus （T2DM） and pancreatic cancer that allows dynamic observation of tumor formation process and facilitates in vivo research. Methods At first， human pancreatic cancer PANC-1 cells were transfected with lentiviral vector GV260 to construct the pancreatic cancer cell line PANC-1-Luc with stable expression of firefly luciferase. Then， 36 specific pathogen-free nude mice were randomly divided into control group with 12 mice and model group with 24 mice （nude mice with T2DM and pancreatic cancer）. The mice in the control group were fed with breeding diet and were then given ectopic subcutaneous implantation of PANC-1-Luc cells， and those in the model group were first given high-fat diet and intraperitoneal injection of 1% STZ， followed by ectopic subcutaneous implantation of PANC-1-Luc cells. The fluorescence in vivo imaging system and the manual measurement method were used for simultaneous and dynamic monitoring of the growth of pancreatic cancer in nude mice in the two groups， and the tumor growth curve was plotted to investigate the correlation between fluorescence value and tumor volume. Subcutaneous tumors and pancreatic islets were observed under a microscope to verify whether the model was successfully established， and immunohistochemistry was used to measure the expression of Ki-67 in tumor tissue to investigate the influence of hyperglycemia on the growth of pancreatic cancer in nude mice. The independent-samples t test was used for comparison of normally distributed continuous data between groups， and the Mann-Whitney U test was used for comparison of non-normally distributed continuous data between groups. Results The optimal virus titer was determined as 5×107 TU/mL for the stable transfection of lentiviral vector in PANC-1 cells， and the optimal concentration selected with puromycin was 20 μg/mL， with an optimal selection time of 9 days. The fluorescence value of PANC-1-Luc cells was linearly and positively correlated with the number of cells， with the linear equation of y=42.56x－42 504 （r=0.977， P=0.004）. The blood glucose value of T2DM nude mice was 23.05 （19.25 — 26.40） mmol/L， with a blood glucose level of >11.1 mmol/L in each nude mouse， and there was a significant difference in blood glucose value between the T2DM nude mice and the control nude ［6.15 （5.20 — 7.30） mmol/L］ （Z=-8.45， P<0.001）. Compared with the control group， the model group had reductions in the number and volume of pancreatic islets， with irregular shapes and unclear boundaries， and pathological examination confirmed that the xenograft tumor was pancreatic cancer tissue， which showed that the model was established successfully. In the model group， there was a linear positive correlation between subcutaneous tumor size and fluorescence values， with the linear equation of y=232 348 691x－8 258 608 （r=0.911， P=0.031）. The model group had a significantly higher positive rate of Ki-67 than the control group （50.333%± 7.808% vs 15.917%±4.055%， t=13.55， P<0.001）， suggesting rapid tumor proliferation in the model group. Conclusion The T2DM nude mouse model of pancreatic cancer established in this study can simulate the pathological process of the development and progression of pancreatic cancer in the context of T2DM and dynamically observe the influence of hyperglycemia on the growth of pancreatic cancer cells in vivo， thereby providing a new experimental vector for the in vivo study of the development and progression of pancreatic cancer in the context of T2DM. -
Key words:
- Diabetes Mellitus， Type 2 /
- Pancreatic Neoplasms /
- Disease Models， Animal
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胰腺癌是世界上最常见和最具破坏性的消化道恶性肿瘤之一，5年总生存率不到10%，大部分患者晚期生存期仅为3～6个月，并且超过85%的胰腺癌是胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）［1］。胰腺癌起病隐匿、转移迅速，这也是绝大部分患者的死亡原因［1-2］，然而其机制尚未得到充分阐明。此外，临床研究［3-6］发现降糖治疗能降低肝癌、肺癌等多种肿瘤的转移风险，相反高血糖能加速肝癌、乳腺癌等多种肿瘤的进展。而胰腺的内分泌部有调节血糖的功能，因此高血糖与胰腺癌的关系可能更为密切和复杂。研究［3，7］表明，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）可能既是胰腺癌发生及转移的独立危险因素，也是胰腺癌导致的结果。有学者通过体外细胞学实验研究［4，8-9］发现，一方面高血糖可以促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化，另一方面高血糖还可以促进糖酵解，加上高血糖导致的缺氧环境，从而促进胰腺癌的进展［10-12］。但这些结论和分子机制还需体内实验进一步加以证实。因此，构建一种便于动态观察和研究的动物模型用于体内实验尤为重要。T2DM或胰腺癌的独立动物模型比较多见，而T2DM合并胰腺癌、并可动态观察成瘤过程的动物模型少见报道。本研究先建立T2DM裸鼠模型，再在裸鼠模型上种植能通过荧光素酶发光的PDAC异位肿瘤，最终建立可通过活体成像动态观察成瘤过程的T2DM裸鼠胰腺癌模型，为糖尿病促进胰腺癌发生、发展机制的体内研究创造条件。
1. 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系及材料
人胰腺癌导管细胞PANC-1来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库、细胞培养基Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司、胎牛血清（FBS）购自苏州依科赛生物科技股份有限公司、青链霉素购自北京Solarbio公司。
1.1.2 转染慢病毒载体及转染试剂
慢病毒载体GV260（Ubi-firefly Luciferase-IRES-Puromycin带有氨苄霉素抗性基因和嘌呤霉素抗性基因）、HitransG A感染增强液（25×）、HitransG P感染增强液（25×）皆购自上海吉凯公司，嘌呤霉素（Biosharp）购自北京兰杰柯科技有限公司，荧光素酶检测试剂盒Bright-Glo™ Luciferase Assay System（E2610）购自美国Promega公司。
1.1.3 实验动物和饲料、试剂
36只SPF级3周龄雄性BALB-C/nu裸鼠，体质量（9.0±1.0）g，购自斯贝福（北京）生物有限公司［实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010］，饲养于广西医科大学实验动物中心SPF级屏障区环境内［实验动物使用许可证编号：SCXK（桂）2020-0003］，在独立通气笼中，严格控制12 h光照和12 h黑暗，环境设定为相对湿度60%±5%，温度（22±2）℃，期间自由进食和进水，饮水为实验动物中心的灭菌蒸馏水。动物适应性喂养1周后再开始实验。高脂饲料（60%脂肪比/SPF纯化型）购自北京博爱港公司，链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）购自美国Sigma公司，无菌柠檬酸钠缓冲液（pH4.5）购自北京Solarbio公司，血糖测试仪器及其配套的血糖试纸均购自德国罗氏血糖健康医护公司，荧光素底物D-Luciferin potassium Salt购自美国Gold Biotechnology公司，10%中性福尔马林固定液（Biosharp）购自北京兰杰柯科技有限公司，重组Anti-Ki67抗体（ab16667）购自英国Abcam公司。
1.1.4 matrigel基质胶/基底膜
matrigel基质胶/基底膜购自ABW上海诺娃医药科技有限公司（产品编号：0827245），高浓度，-20 ℃下冷冻保存，避免多次冻融。
1.1.5 活体成像系统及酶标仪
AniView100多模式动物活体成像系统（广州博鹭腾生物科技有限公司）仪器序列号：AV100-1222-3404C，相机序列号：Q5627。BioTek SynergyH1多功能酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞系筛选条件的确立
将PANC-1细胞接种到24孔板，每孔细胞数为2.5×104个，加入不同浓度（0、15、17.5、20 μg/mL）的嘌呤霉素（0 μg/mL作为对照组），每个浓度设3个复孔，选取9天能杀死99%及以上未表达嘌呤霉素抗性基因的细胞的最低浓度为最佳嘌呤霉素工作浓度。
1.2.2 细胞的稳定转染及筛选
用DMEM完全培养基将PANC-1细胞制备成细胞悬液，接种于96孔板中，共设置4组细胞，分别是对照组（control组，C组）、慢病毒载体稳定转染常规组（M组），慢病毒载体HitransG A感染增强液转染组（A组）和慢病毒载体HitransG P感染增强液转染组（P组）。每组设3个孔，共12孔。首先按照每孔3×103个细胞的数量接种细胞，并在每孔中添加100 μL完全培养基，37 ℃培养箱培养16 h左右，观察细胞融合度达到30%左右时，准备感染：C组弃上清，更换完全培养基，每孔100 μL；M组弃上清，更换完全培养基，每孔90 μL，并按1×107、5×107、1×108 TU/mL 3个滴度分别添加10 μL慢病毒载体至M组3个孔中；A组、P组弃上清，更换完全培养基，每孔86 μL，并按1×107、5×107、1×108 TU/mL 3个滴度分别添加10 μL慢病毒载体至A组3个孔、P组3个孔中，另外A组每孔添加4 μL HitransG A感染增强液，P组每孔添加4 μL HitransG P感染增强液。16 h后，12孔细胞皆更换完全培养基，每孔100 μL，继续培养2～3天，再用嘌呤霉素筛选转染细胞，最终得到能稳定表达萤火虫荧光素酶的PANC-1细胞（PANC-1-Luc细胞），期间根据细胞生长情况，每1～3日更换1次培养基。之后，按照1.2.1确立的实验条件筛选去除未被转染的细胞。
1.2.3 荧光素酶活性测定
E2610试剂盒（Promega）准备：将1瓶Bright-Glo™缓冲液中的内容物转移到1瓶Bright-Glo™底物中，颠倒混合，直到底物完全溶解，作为试剂盒工作液。将Panc-1细胞（对照组）以及嘌呤霉素筛选后的PANC-1-Luc细胞（实验组）提前一天接种于全白96孔细胞培养板上，每组细胞均设3个复孔。接种后24 h，吸弃上清，用PBS洗1次，将E2610试剂盒工作液平衡至室温22 ℃左右，按照每孔100 μL的量将工作液分别加入各孔内，缓慢摇动培养板数次以确保工作液完全覆盖细胞，室温孵育5 min后，使用多功能酶标仪检测发光数值，结果判定标准： 实验组数值均值>对照组数值均值+3×对照组标准差。
1.2.4 稳定表达萤火虫荧光素酶的PANC-1-Luc细胞传代培养
将能够稳定表达生物发光的PANC-1-Luc细胞继续传代培养、增殖，每传代5次左右就重新按1.2.1确立的实验条件进行嘌呤霉素筛选，并且重新检测一次荧光素酶活性，分析PANC-1-Luc荧光值与细胞数量之间的关系。
1.2.5 建立T2DM裸鼠模型
取雄性BALB/c-nu裸鼠36只，随机选取12只作为对照组（血糖正常的胰腺癌裸鼠），24只作为模型组（T2DM胰腺癌裸鼠）。对照组只给予繁殖饲料喂养；模型组则给予高脂饲料喂养。4周后，模型组腹腔注射1% STZ溶液建立T2DM模型。STZ以无菌柠檬酸钠缓冲液溶解，配制成1%溶液，对模型组裸鼠进行12 h禁食后，根据体质量按照160 mg/kg予以腹腔注射，注射1周后通过剪尾采血的方式测定禁食5 h血糖值，连续3次血糖值≥11.1 mmol/L［13-15］，即认为T2DM裸鼠模型构建成功。模型稳定2周后接种肿瘤。（按1.2.8最终处死模型鼠后，通过对其胰腺组织进行病理学检查可从形态学上证实胰岛病变，再次证实T2DM裸鼠模型构建成功）。
1.2.6 建立可用于活体成像的T2DM裸鼠胰腺癌模型
异种移植瘤模型选取右侧背部或右侧腋下为种植点，对模型组和对照组裸鼠分别进行种植：使用75%酒精对右侧背部或右侧腋下皮肤消毒后，用1 mL无菌注射器吸取100 µL能够稳定表达生物发光的PANC-1-Luc细胞悬液（细胞悬液由基质胶及完全培养基按1∶1的比例配制重悬）注射于裸鼠右侧背部或者右侧腋下，每只裸鼠接种细胞数量约1×107个，接种后每日观察肿瘤生长情况，并且每周对裸鼠称重。待肿瘤明显增大后，每隔7天测量肿瘤长径L和与短径W，计算肿瘤体积V=1/2×L×W2（cm3），并绘制肿瘤的生长曲线。
1.2.7 T2DM裸鼠胰腺癌模型的活体成像观察
对模型组和对照组胰腺癌裸鼠分别进行定期活体成像观察，此过程中如果动物体质量短时间内明显下降、皮下脂肪消失、动物出现脊柱弯曲、活动和反应能力下降，则提前实施安乐死，其余进行活体成像。成像时D-Luciferin potassium Salt工作液（预先用DPBS配制，浓度为15 mg/mL）按照10 µL/g的剂量予以裸鼠腹腔注射，10～15 min后异氟烷麻醉，再使用AniView100多模式动物活体成像系统进行活体成像观察，每次活体成像的时间点与测量肿瘤的时间点保持一致——即同时用荧光成像系统和人工测量法动态监测模型组和对照组裸鼠胰腺癌生长情况，从而分析荧光值与肿瘤体积的关系、高血糖对裸鼠胰腺癌生长的影响。
1.2.8 对移植瘤和胰腺组织（主要是胰岛部分）进行病理学检查
模型组及对照组裸鼠统一处死后分别取出肿瘤组织和胰腺，用10%中性福尔马林固定液固定，并将组织制成石蜡切片，在光镜下观察移植瘤及胰岛的病理学形态。
1.2.9 免疫组化染色及结果判定
对模型组及对照组裸鼠的移植瘤进行免疫组化染色，检测增殖指数蛋白Ki-67的表达，方法如下：采用通用两步法，将包埋好的组织蜡块以4 μm厚度切片，脱蜡水化后进行抗原修复、再阻断内源性过氧化物酶，随后按照使用说明书滴加一抗（ki-67工作浓度为1∶200）、二抗、反应增强液，最后DAB显色、苏木素染色液复染、酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
免疫组化结果判定标准：细胞核呈浅棕色、棕黄色、深棕色均认为是阳性，评估肿瘤热点区Ki-67阳性细胞所占百分比。切片由2位主治以上病理医师完成结果判定。
1.3 统计学方法
采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析、Graphpad Prism 9.5.1制作统计图。符合正态分布的计量资料以
2. 结果
2.1 细胞系筛选所用嘌呤霉素最佳浓度的确定
细胞系筛选实验通过多浓度梯度嘌呤霉素对PANC-1细胞进行筛选，最终确定嘌呤霉素筛选的最佳浓度为20 μg/mL，筛选时间为9天（图1）。嘌呤霉素筛选前后细胞形态无明显改变（图2）。
注： a，第3天；b，第5天；c，第7天；d，第9天。图 1 细胞系筛选实验（×180）Figure 1. Cell line screening experiment （×180）
注： a，未经筛选的细胞；b，经嘌呤霉素筛选后的细胞。图 2 细胞系筛选实验前后细胞形态对比（×180）Figure 2. Comparison of cell morphology before and after cell line screening experiment （×180）2.2 慢病毒载体稳定转染的最佳病毒滴度的确定及转染后筛选
PANC-1细胞慢病毒载体稳定转染的最佳病毒滴度为5×107 TU/mL，无须添加HitransG A或HitransG P感染增强液，转染前后细胞形态无明显改变，均呈上皮细胞样生长（图3）。之后，用20 μg/mL嘌呤霉素作用9天以筛选去除未被转染的细胞。
注： a，PANC-1（转染前）；b，（转染后）PANC-1-Luc。图 3 慢病毒载体转染前后细胞形态对比（×180）Figure 3. Comparison of cell morphology before and after lentiviral vector transfection （×180）2.3 荧光素酶活性检测结果
以每孔2.5×104个细胞种板，对照组PANC-1的荧光值为（52.33±0.58）lum，实验组PANC-1-Luc的荧光值为（385 842.00±7 563.65）lum，后者的荧光值明显增高，差异有统计学意义（t=88.35，P<0.001）（图4a）；之后，以不同的细胞数种入细胞板，探究PANC-1-Luc荧光值与细胞数量的关系：细胞数量分别为6 000、12 000、18 000、24 000、30 000个/孔时，荧光值分别为296 423.67、448 264.33、607 027.67、938 050.00、1 328 438.00 lum。PANC-1-Luc的荧光值跟细胞数量呈正相关，荧光值随细胞数量的增多而增大（r=0.977，P=0.004），线性方程为y=42.56x－42 504（图4b、c）。
注： a，实验组和对照组的荧光值比较；b，不同细胞数量PANC-1-Luc荧光值的比较；c，PANC-1-Luc荧光值跟细胞数量呈线性正相关。图 4 PANC-1-Luc的荧光值及其与细胞数量的关系Figure 4. Fluorescence values of PANC-1-Luc and its relationship with cell number2.4 T2DM裸鼠模型的建立
模型组裸鼠的血糖值为23.05（19.25～26.40） mmol/L，且每只裸鼠每次的血糖均高于11.1 mmol/L，对照组裸鼠的血糖值为6.15（5.20～7.30） mmol/L，且每只裸鼠每次的血糖均低于11.1 mmol/L，差异有统计学意义（Z=-8.45，P<0.001）。
2.5 T2DM裸鼠胰腺癌模型的建立及活体成像观察
采用AniView100多模式动物活体成像系统分别对模型组和对照组裸鼠进行定期活体成像观察（图5）。皮下肿瘤生长稳定后第1～5周，分别截取5组同样的成瘤时间点。在一定时间范围内，模型组裸鼠的皮下肿瘤体积均大于对照组（P值均<0.05）（表1）。
注： a，模型组；b，对照组。图 5 模型组及对照组第5周皮下肿瘤的活体生物发光成像Figure 5. Vivo bioluminescence imaging of subcutaneous tumors in the model group and the control group at week 5表 1 模型组及对照组裸鼠皮下肿瘤大小变化（cm3）Table 1. Changes in subcutaneous tumor size of nude mice in the model group and the control group （cm3）时间 对照组（n=12） 模型组（n=24） t值 P值 第1周 0.013±0.007 0.036±0.021 3.535 0.004 第2周 0.020±0.012 0.046±0.022 3.490 0.002 第3周 0.027±0.015 0.051±0.023 3.490 0.002 第4周 0.035±0.019 0.061±0.034 2.285 0.035 第5周 0.039±0.019 0.070±0.037 2.549 0.018 同时，模型组裸鼠皮下肿瘤的荧光值均大于对照组（P值均<0.05）（表2）。模型组及对照组的皮下肿瘤体积随着时间增长逐渐增大（图6），皮下肿瘤在体内成像的荧光值也随着时间增长而逐渐增大（图7）。在一定时间范围内，模型组裸鼠皮下肿瘤大小与荧光值成正相关（r=0.911，P=0.031），线性方程为y=232 348 691x－8 258 608（图8、9）。
表 2 模型组及对照组裸鼠皮下肿瘤荧光值变化（p⋅s-1⋅cm-2⋅sr-1）Table 2. Changes in subcutaneous tumor values of nude mice in the model group and the control group （p·s-1·cm-2·sr-1）时间 对照组（n=12） 模型组（n=24） t值 P值 第1周 6 460.83±4 200.33 985 416.67±97 565.32 34.726 <0.001 第2周 28 169.17±20 112.81 2 029 250.00±612 538.25 11.311 <0.001 第3周 131 601.67±101 868.71 3 251 666.67±981 546.40 10.953 <0.001 第4周 174 560.00±133 203.77 3 897 500.00±1 248 631.07 10.270 <0.001 第5周 359 734.17±236 685.20 9 650 833.33±4 384 569.45 7.330 <0.001 
图 6 模型组及对照组裸鼠皮下肿瘤大小变化Figure 6. Changes in the size of subcutaneous tumors in nude mice in the model group and the control group
图 7 模型组及对照组裸鼠皮下肿瘤荧光值动态变化Figure 7. Dynamic changes in subcutaneous tumor fluorescence values in the model group and the control group
图 8 模型组裸鼠荧光值与肿瘤生长体积动态分析Figure 8. Dynamic analysis of fluorescence values and tumor growth volume in the model group
图 9 模型组裸鼠荧光值与肿瘤体积相关性分析Figure 9. Correlation analysis between fluorescence values and tumor volume in the model group2.6 模型组及对照组裸鼠的移植瘤和胰腺组织（主要是胰岛部分）的病理学检查结果
T2DM裸鼠胰腺癌模型皮下荷瘤稳定后第5周时处死模型鼠和对照组裸鼠，并取出皮下肿瘤进行肉眼观察，可见：肿物直径0.20～0.77 cm，椭圆形、灰白灰红色，切面与表面颜色一致，质地稍硬脆，未见囊肿、出血及坏死（图10）。显微镜下观察：低倍镜下，肿瘤位于皮下肌组织间，呈巢团分布，排列紊乱，可见侵及神经；高倍镜下，肿瘤细胞排列紧密、分界不清，细胞异型性明显、核深染、核浆比增大，染色质增粗，可见明显核仁，核分裂像易见（图11）。
注： a，模型组（部分示例）；b，对照组（部分示例）。图 10 模型组和对照组裸鼠形成的皮下肿瘤肉眼观察Figure 10. Macroscopic observation of subcutaneous tumors formed in nude mice in the model group and the control group
注： a，×40，白色箭头为胰腺癌形成皮下肿瘤，红色箭头为肌肉组织，黑色箭头为皮肤及皮脂腺；b，×400。图 11 模型组裸鼠皮下肿瘤HE染色Figure 11. The histological observation of subcutaneous tumors in the model group with HE staining under a microscope在取出皮下肿瘤的同时也分别取每只裸鼠的胰腺组织，肉眼观见组织为淡粉色，质软，未见出血及坏死。显微镜下观察，可见：对照组胰腺组织内胰岛均匀分布，呈圆形或卵圆形，边界清楚；模型组胰腺组织内胰岛数量减少、体积减小、形状不规则、边界模糊（图12）。形态学结合血糖值，可判定第一阶段的T2DM裸鼠模型造模成功。
注： a，对照组；b，模型组；箭头处为胰岛。图 12 对照组与模型组裸鼠胰岛组织HE染色（×200）Figure 12. HE staining of pancreatic islet tissue in the control group and model group （×200）2.7 免疫组化染色结果
对皮下肿瘤免疫组化Ki-67染色阳性率进行分析，对照组为（15.917±4.055）%，模型组为（50.333±7.808）%，对照组明显低于模型组（t=13.55，P<0.001）（图13）。
注： a，对照组；b，模型组。图 13 对照组与模型组裸鼠皮下肿瘤Ki-67免疫组化结果（×200）Figure 13. Immunohistochemical results of subcutaneous tumor Ki-67 in the control group and model group （×200）3. 讨论
STZ对胰腺内分泌部的胰岛β细胞有选择性破坏作用。研究［16-19］表明，大剂量注射STZ可广泛破坏胰岛β细胞，从而构建1型糖尿病模型；而小剂量注射STZ结合高脂饲料喂养则可在破坏一部分胰岛β细胞的同时造成外周组织对胰岛素的敏感性下降，从而构建T2DM模型。本研究中T2DM模型组裸鼠的血糖值为23.05（19.25～26.40）mmol/L，且每只裸鼠每次的血糖均高于11.1 mmol/L，与对照组相比差异有统计学意义。在实验结束最终处死模型组和对照组裸鼠后，取每只裸鼠的胰腺组织进行HE染色，镜下观察胰岛组织结构的差异，发现模型组较对照组裸鼠而言，其胰岛数量减少、体积减小、形状不规则、边界模糊。以上就从血糖指标及病理形态改变两方面证实了本研究第一阶段造模成功（即T2DM裸鼠模型造模成功）［13-15］，在此基础上继续建立T2DM裸鼠胰腺癌模型。传统的荷瘤模型无法对成瘤过程进行精准的动态观察。于是，基于生物发光的活体成像技术（intravital imaging，IVI）应运而生。IVI可用于观察活体动物的肿瘤形成和转移等，克服活体动物肿瘤难以观察的障碍［20-21］。其中基于荧光素酶报告基因的生物发光成像（bioluminescence imaging，BLI）是活体动物无创可视化的重要方法，其原理是利用荧光素酶催化小分子荧光素氧化形成发光的激发态物而产生生物发光。BLI目前已广泛应用于临床前啮齿动物模型，用于了解肿瘤等疾病的发展过程并评估潜在的细胞或基因治疗方法［22-23］。BLI是一种非侵入性的科研方法，由于其具有灵敏度高、分辨率高、选择性强、背景信号低和无需外部光激发等优点而被广泛应用于动物实验［24-26］。
为了成功地构建可以通过BLI进行动态观察的T2DM裸鼠胰腺癌模型，本研究首先探索运用慢病毒载体GV260对PANC-1细胞进行稳定转染的条件和对未转染细胞的筛选条件，最终确定PANC-1细胞慢病毒载体稳定转染的最佳条件如下：病毒滴度为5×107 TU/mL，无须添加HitransG A或HitransG P感染增强液。之后，用20 μg/mL嘌呤霉素作用9天以筛选去除未被转染的细胞，得到能表达荧光素酶的PANC-1-Luc细胞［26-27］。转染前后及筛选前后细胞均呈上皮细胞样生长，形态无明显改变。体外实验发现，在一定范围内，PANC-1-Luc的荧光值跟细胞数量成正相关，荧光值随细胞数量的增多而增大（r=0.977，P=0.004），线性方程为y=42.56x－42 504。说明实验得到的PANC-1-Luc能在保留细胞活性的同时稳定表达荧光素酶，可以用于裸鼠皮下成瘤并通过BLI进行动态观察。T2DM模型组和对照组裸鼠的右侧背部或者右侧腋窝皮下分别注射一定量的PANC-1-Luc，一段时间后大部分裸鼠可观察到皮下肿瘤肿块。皮下肿瘤生长稳定后第1～5周，分别截取5组同样的成瘤时间点，发现T2DM裸鼠胰腺癌模型组皮下肿瘤的荧光值以及增殖指数蛋白Ki-67的表达均高于对照组，且差异有统计学意义［28-29］。此结果说明：T2DM裸鼠体内胰腺癌细胞的生长速度远远快于对照组；在体内环境下，高血糖的确能促进胰腺癌细胞的生长。此外，本研究还发现：模型组的皮下肿瘤体积随着时间增长逐渐增大，皮下肿瘤在体内成像的荧光值也随着时间增长而逐渐增大，并且在一定时间范围内，模型组皮下肿瘤大小与荧光值成正相关（r=0.911，P=0.031），线性方程为y=232 348 691x－8 258 608，但该直线不过原点。说明利用表达荧光素酶的PANC-1-Luc细胞构建的T2DM裸鼠胰腺癌模型可通过BLI动态观察肿瘤的生长，该模型具有客观、动态、灵敏、可视化评估T2DM背景下胰腺癌发生发展的优点［30-31］。但是，皮下肿瘤大小与荧光值之间的线性关系不过原点，说明受活体成像系统灵敏度的影响，过于微小的皮下肿瘤细胞团产生的荧光尚不足以被活体成像系统捕捉，只有当肿瘤长到一定程度时才能被活体成像系统检测到，使实验不可避免地存在一些误差。但这一误差必将随着活体成像系统的不断改进而逐渐减小。最后，通过处死模型鼠并进行移植瘤病理学检查确认镜下为胰腺癌组织，造模成功。
综上所述，本研究所构建的T2DM裸鼠胰腺癌模型可模拟T2DM背景下胰腺癌发生发展的病理过程，动态观察高血糖对体内胰腺癌细胞生长的影响，从而能够为T2DM胰腺癌发生发展的体内研究提供新的实验载体。但是，由于实验中用到的裸鼠是免疫缺陷小鼠，所以此移植瘤模型仍存在“难以实现肿瘤免疫相关研究”的局限性。若需要研究肿瘤免疫相关问题，可将裸鼠替换为KPC转基因小鼠等免疫健全小鼠，将人源性PDAC细胞株替换为小鼠源性PDAC细胞株，但此时又存在小鼠源性肿瘤能否真实还原人类肿瘤复杂性的问题。
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注： a，第3天；b，第5天；c，第7天；d，第9天。
图 1 细胞系筛选实验（×180）
Figure 1. Cell line screening experiment （×180）
注： a，未经筛选的细胞；b，经嘌呤霉素筛选后的细胞。
图 2 细胞系筛选实验前后细胞形态对比（×180）
Figure 2. Comparison of cell morphology before and after cell line screening experiment （×180）
注： a，PANC-1（转染前）；b，（转染后）PANC-1-Luc。
图 3 慢病毒载体转染前后细胞形态对比（×180）
Figure 3. Comparison of cell morphology before and after lentiviral vector transfection （×180）
注： a，实验组和对照组的荧光值比较；b，不同细胞数量PANC-1-Luc荧光值的比较；c，PANC-1-Luc荧光值跟细胞数量呈线性正相关。
图 4 PANC-1-Luc的荧光值及其与细胞数量的关系
Figure 4. Fluorescence values of PANC-1-Luc and its relationship with cell number
注： a，模型组；b，对照组。
图 5 模型组及对照组第5周皮下肿瘤的活体生物发光成像
Figure 5. Vivo bioluminescence imaging of subcutaneous tumors in the model group and the control group at week 5
图 6 模型组及对照组裸鼠皮下肿瘤大小变化
Figure 6. Changes in the size of subcutaneous tumors in nude mice in the model group and the control group
图 7 模型组及对照组裸鼠皮下肿瘤荧光值动态变化
Figure 7. Dynamic changes in subcutaneous tumor fluorescence values in the model group and the control group
图 8 模型组裸鼠荧光值与肿瘤生长体积动态分析
Figure 8. Dynamic analysis of fluorescence values and tumor growth volume in the model group
图 9 模型组裸鼠荧光值与肿瘤体积相关性分析
Figure 9. Correlation analysis between fluorescence values and tumor volume in the model group
注： a，模型组（部分示例）；b，对照组（部分示例）。
图 10 模型组和对照组裸鼠形成的皮下肿瘤肉眼观察
Figure 10. Macroscopic observation of subcutaneous tumors formed in nude mice in the model group and the control group
注： a，×40，白色箭头为胰腺癌形成皮下肿瘤，红色箭头为肌肉组织，黑色箭头为皮肤及皮脂腺；b，×400。
图 11 模型组裸鼠皮下肿瘤HE染色
Figure 11. The histological observation of subcutaneous tumors in the model group with HE staining under a microscope
注： a，对照组；b，模型组；箭头处为胰岛。
图 12 对照组与模型组裸鼠胰岛组织HE染色（×200）
Figure 12. HE staining of pancreatic islet tissue in the control group and model group （×200）
注： a，对照组；b，模型组。
图 13 对照组与模型组裸鼠皮下肿瘤Ki-67免疫组化结果（×200）
Figure 13. Immunohistochemical results of subcutaneous tumor Ki-67 in the control group and model group （×200）
表 1 模型组及对照组裸鼠皮下肿瘤大小变化（cm3）
Table 1. Changes in subcutaneous tumor size of nude mice in the model group and the control group （cm3）
时间 对照组（n=12） 模型组（n=24） t值 P值 第1周 0.013±0.007 0.036±0.021 3.535 0.004 第2周 0.020±0.012 0.046±0.022 3.490 0.002 第3周 0.027±0.015 0.051±0.023 3.490 0.002 第4周 0.035±0.019 0.061±0.034 2.285 0.035 第5周 0.039±0.019 0.070±0.037 2.549 0.018 
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表 2 模型组及对照组裸鼠皮下肿瘤荧光值变化（p⋅s-1⋅cm-2⋅sr-1）
Table 2. Changes in subcutaneous tumor values of nude mice in the model group and the control group （p·s-1·cm-2·sr-1）
时间 对照组（n=12） 模型组（n=24） t值 P值 第1周 6 460.83±4 200.33 985 416.67±97 565.32 34.726 <0.001 第2周 28 169.17±20 112.81 2 029 250.00±612 538.25 11.311 <0.001 第3周 131 601.67±101 868.71 3 251 666.67±981 546.40 10.953 <0.001 第4周 174 560.00±133 203.77 3 897 500.00±1 248 631.07 10.270 <0.001 第5周 359 734.17±236 685.20 9 650 833.33±4 384 569.45 7.330 <0.001
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