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下瘀血汤对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病小鼠模型的治疗作用及机制

侯林圻 王知意 赵鑫 张洁 马文婷 刘旭凌 张玮 陶乐 刘成 吴柳

引用本文:
Citation:

下瘀血汤对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病小鼠模型的治疗作用及机制

DOI: 10.12449/JCH240412
基金项目: 

国家自然科学基金面上项目 (82004106);

国家自然科学基金面上项目 (81873136);

普陀医院人才类项目 (2022-RCJC-04);

普陀医院人才类项目 (2022-RCJC-02);

上海市自然基金 (20ZR1450300);

上海市普陀区自主创新项目 (ptkwws202223);

上海市普陀区自主创新项目 (ptkwws202112);

上海市第六人民医院医疗集团科研基金 (21-ly-02);

成都中医药大学杏林学者 (YYZX2020117);

上海市中医药高层次人才引领计划 ([2021-2023]-0403)

伦理学声明:本研究方案于2020年9月11日经由上海市普陀区中心医院实验动物伦理委员会审批,批号:PTEC-A-2020-31-1,符合实验室动物管理与使用准则。
利益冲突声明:本文不存在任何利益冲突。
作者贡献声明:侯林圻负责动物相关实验,数据统计及文章初稿;王知意、赵鑫参与免疫组化染色及相关数据分析;马文婷、张玮、刘旭凌参与细胞实验和资料分析;陶乐、刘成、张洁核对数据和修改论文;吴柳负责课题设计,指导撰写文章并最后定稿。
详细信息
    通信作者:

    吴柳, wlcrystal@126.com (ORCID: 0000-0003-0720-819X)

Therapeutic effect of Xiayuxue decoction on a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet and its mechanism

Research funding: 

National Natural Science Foundation of China (82004106);

National Natural Science Foundation of China (81873136);

Putuo Hospital Talent Project (2022-RCJC-04);

Putuo Hospital Talent Project (2022-RCJC-02);

Shanghai Natural Science Foundation of China (20ZR1450300);

Putuo District of Shanghai Innovation Project (ptkwws202223);

Putuo District of Shanghai Innovation Project (ptkwws202112);

Scientific Research Fund of Shanghai Sixth People’s Hospital Medical Group (21-ly-02);

Xinglin Scholar of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (YYZX2020117);

Shanghai High Level Talent Leadership Plan for Traditional Chinese Medicine ([2021-2023]-0403)

More Information
    Corresponding author: WU Liu, wlcrystal@126.com (ORCID: 0000-0003-0720-819X)
  • 摘要:   目的  探讨下瘀血汤调控核苷酸结合寡聚化结构域样受体含pyrin结构域蛋白6(NLRP6)抑制高脂饮食(HFD)诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的作用机制。  方法  15只雄性C57BL/6小鼠随机分为低脂饮食(LFD)组、HFD组和下瘀血汤-HFD(XYXD)组,每组各5只。测量肝功能指标ALT和AST、血脂代谢指标TG、TC水平;肝组织经过HE染色、油红O染色,观察小鼠组织形态、脂滴沉积;实时荧光定量PCR检测肝组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及NLRP6表达水平;Western Blot检测NLRP6、NF-κB和NF-κB p65蛋白水平;免疫组化检测NLRP6和CD68表达。棕榈酸(PA)、脂多糖(LPS)和下瘀血汤含药血清处理鼠Raw264.7细胞,检测炎症情况。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。  结果  与LFD组比较,HFD组血清ALT、AST和TC、TG水平显著升高(P值均<0.05)。肝组织病理学显示,HFD组肝脂肪变性明显,NAS评分显著升高(P<0.05);实时荧光定量PCR结果显示,IL-1β、IL-18等炎症相关因子显著升高,NLRP6表达显著下调(P值均<0.05)。免疫组化显示NLRP6表达与巨噬细胞标志物CD68重合。Western Blot显示,NLRP6表达下调后,磷酸化的NF-κB p65(p-NF-κB p65)显著上调(P<0.05)。与HFD组相比,下瘀血汤可有效改善HFD小鼠的肝脏炎症,上调NLRP6的表达,下调p-NF-κB p65(P<0.05)。PA处理Raw264.7细胞后下调NLRP6,促进炎症进展(P<0.05);下瘀血汤处理可上调NLRP6,抑制炎症和NF-κB(P<0.05)。  结论  下瘀血汤可显著改善HFD诱导NAFLD小鼠模型的肝脂肪变性和炎症,调控NLRP6/NF-κB减轻巨噬细胞活化可能是其作用机制之一。

     

  • 图  1  各组小鼠HE染色、油红染色结果

    Figure  1.  The results of HE staining and oil red staining in each group

    图  2  各组小鼠肝组织中CD68和NLRP6表达(免疫组化,×400)

    注: 黑色箭头表示CD68阳性,红色箭头表示NLRP6阳性。

    Figure  2.  Expression of CD68 and NLRP6 in liver tissue of mice in each group (IHC stain,×400)

    图  3  各组小鼠肝组织蛋白表达情况

    Figure  3.  Expression of protein in liver of mice in each group

    图  4  PA、LPS和下淤血汤含药血清处理鼠Raw264.7细胞后CD68、TNF-α、IL-6的表达变化

    注:*P<0.05,**P<0.01。

    Figure  4.  The expression of CD68, TNF-α and IL-6 in Raw264.7 cells treated with PA, LPS and serum containing Xiayuxue decoction

    图  5  PA、LPS和下淤血汤含药血清处理鼠Raw264.7细胞后p-NF-κB、NLRP6蛋白表达情况

    Figure  5.  The expression of p-NF-κB and NLRP6 protein in rat Raw264.7 cells treated with PA, LPS and serum containing Xiayuxue decoction

    表  1  引物序列表

    Table  1.   Primer sequence table

    基因 上游(5′-3′) 下游(5′-3′)
    18S GTAACCCGTTGAACCCCATT CCATCCAATCGGTAGTAGCG
    TNF-α ATGAGAGGGAGGCCATTTG CAGCCTCTTCTCATTCCTGC
    IL-1β AGGTCAAAGGTTTGGAAGCA TGAAGCAGCTATGGCAACTG
    CD68 ACATTGTATTCCACCGCCAT CATCCCCACCTGTCTCTC
    IL-18 AACCGCAGTAATACGGAGCA CTGGTCTGGGATTCGTTGG
    NLRP6 CTCGCTTGCTAGTGACTACAC AGTGCAAACAGCGTCTCGTT
    Caspase-1 ACAAGGCACGGGACCTATG TCCCAGTCAGTCCTGGAAATG
    ASC TGAGCAGCTGCAAACGACTA AGGAGGAACAGTTAAGCGCC
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    表  2  各组小鼠血清转氨酶及血脂水平

    Table  2.   Serum transaminase and blood lipid levels of mice in each group

    组别 动物数(只) ALT(U/L) AST(U/L) TC(μmol/L) TG(μmol/L)
    LFD组 5 7.94±3.15 4.31±2.63 1.19±0.08 0.53±0.19
    HFD组 5 85.31±31.991) 52.06±19.451) 1.87±0.341) 2.68±1.291)
    XYXD组 5 23.17±8.572) 15.36±6.732) 1.34±0.232) 1.14±0.172)
    F 22.76 21.77 10.08 10.49
    P 0.000 1 0.000 1 0.003 0.002
    注:与LFD组比较,1)P<0.05;与HFD组比较,2)P<0.05。
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    表  3  各组小鼠肝脏油红染色半定量及NAS评分比较

    Table  3.   Semi quantitative oil red staining and NAS score of liver in each group of mice

    组别 动物数(只) 油红染色阳性面积(%) NAS评分
    LFD组 5 0.83±0.26 1.33±0.21
    HFD组 5 34.20±4.871) 5.50±0.431)
    XYXD组 5 6.27±1.202) 3.17±0.482)
    F 34.52 28.72
    P 0.000 1 0.000 1
    注:与LFD组比较,1)P<0.05;与HFD组比较,2)P<0.05。
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    表  4  各组小鼠肝组织中炎症相关因子mRNA相对表达量比较

    Table  4.   Comparison of relative expression levels of inflammatory related factor mRNA in liver tissues of mice in each group

    组别 IL-1β TNF-α CD68 IL-18 NLRP6 Caspase-1 ASC
    LFD组 1.00±0.61 0.83±0.45 1.00±0.25 1.00±0.30 1.00±0.24 1.03±0.45 1.00±0.29
    HFD组 2.63±0.661) 12.19±8.671) 3.81±2.911) 4.43±3.391) 0.41±0.251) 4.87±0.911) 2.50±1.141)
    XYXD组 1.56±0.992) 2.77±2.022) 1.56±0.412) 1.80±0.802) 0.76±0.302) 2.36±0.722) 1.43±0.882)
    F 11.44 15.74 8.58 8.80 12.62 36.67 8.37
    P 0.000 2 0.000 1 0.001 0.001 0.000 1 <0.000 1 0.001
    注:与LFD组比较,1)P<0.05;与HFD组比较,2)P<0.05。
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    表  5  各组小鼠肝组织中CD68和NLRP6含量半定量分析

    Table  5.   Semiquantitative analysis of CD68 and NLRP6 content in liver tissue of mice in each group

    组别 CD68阳性面积(%) NLRP6阳性面积(%)
    LFD组 1.27±0.99 5.22±2.20
    HFD组 11.11±3.901) 0.69±0.361)
    XYXD组 5.56±1.672) 3.84±2.17
    F 11.56 7.98
    P 0.009 0.020
    注:与LFD组比较,1)P<0.05;与HFD组比较,2)P<0.05。
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    表  6  各组小鼠肝组织中p-NF-κB和NLRP6含量灰度值半定量分析

    Table  6.   Semiquantitative analysis of p-NF-κB and NLRP6 content in liver of mice in each group

    组别 p-NF-κB灰度值 NLRP6灰度值
    LFD组 4.89±0.86 17.43±2.06
    HFD组 23.31±2.441) 4.42±1.201)
    XYXD组 11.91±0.842) 14.52±2.212)
    F 35.16 13.25
    P 0.000 1 0.000 5
    注:与LFD组比较,1)P<0.05;与HFD组比较,2)P<0.05。
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    表  7  体外实验中炎症因子mRNA相对表达量比较

    Table  7.   Comparison of relative expression levels of inflammatory factor mRNA in vitro

    组别 IL-1β TNF-α IL-18 NLRP6
    对照组 1.00±0.05 1.00±0.15 1.00±0.34 1.00±0.14
    PA组 4.87±0.211) 3.55±0.011) 5.57±1.951) 0.63±0.041)
    PA+XYXD组 2.28±0.392) 2.76±0.532) 2.71±0.112) 1.28±0.292)
    F 177.64 51.00 12.16 9.32
    P 0.000 1 0.000 1 0.008 0.014
    注:与对照组比较,1)P<0.05;与PA组比较,2)P<0.05。
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    表  8  体外试验中p-NF-κB和NLRP6含量灰度值半定量分析

    Table  8.   Semiquantitative analysis of p-NF-κB and NLRP6 content in vitro

    组别 p-NF-κB灰度值(%) NLRP6灰度值(%)
    对照组 0.31±0.16 54.57±3.44
    XYXD组 3.27±0.08 63.25±2.06
    PA组 99.13±3.031) 21.42±2.021)
    PA+XYXD组 32.83±10.832) 53.53±14.682)
    F 262.96 19.04
    P 0.000 1 0.005
    注:与对照组比较,1)P<0.05;与PA组比较,2)P<0.05。
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-06-05
  • 录用日期:  2023-08-03
  • 出版日期:  2024-04-11
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