对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是最常用的非处方解热镇痛类药物之一，在治疗窗口内被认为相对安全。然而，APAP过量服用会导致急性肝损伤，包括肝细胞死亡和中央叶坏死。进而，在严重情况下会导致急性肝衰竭（acute liver failure，ALF），甚至死亡。事实上，在肝损伤的发展过程中普遍伴随着肝再生过程。肝再生是指肝脏在受到损伤后肝细胞进行增殖，从而恢复正常肝脏功能的过程。肝脏中的多种细胞类型都可以发挥增殖的功能并最终使肝脏恢复到原有的质量和功能，其中包括肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞和内皮细胞。APAP诱导肝损伤后肝再生过程所涉及的机制极其复杂，包括氧化应激、线粒体相关功能障碍、内质网应激、自噬等多个过程。因此，探究肝再生在APAP诱导肝损伤修复中的作用机制对临床治疗ALF患者具有重要意义。

1.   APAP肝损伤与肝再生

APAP诱导的肝细胞死亡和中央叶坏死是由其有毒代谢物N-乙酰对苯醌亚胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI）引起的。正常情况下，NAPQI与细胞谷胱甘肽（glutathione，GSH）结合后排泄，但APAP过量后积累的NAPQI耗尽了细胞GSH储备，并与细胞蛋白质（主要是线粒体蛋白质）形成APAP加合物，最终导致线粒体损伤、线粒体释放细胞死亡介质和坏死^［1-3］。然而，由于强烈的代偿性肝再生反应，大多数APAP过量服用的患者可自发恢复。在这种代偿性再生反应中，死亡的肝细胞被坏死区周围新形成的细胞所替代，从而恢复正常的肝脏质量和功能。许多研究已经将强烈的肝再生与APAP诱导ALF患者的良好预后相关联^［4］。因此，及时启动肝再生是治疗APAP诱导的ALF的潜在治疗方法，了解肝再生的机制对于开发潜在的治疗靶点非常重要。

在过去，大多数的相关研究都利用部分肝切除模型来研究肝再生的潜在机制。然而，APAP诱导的肝损伤后的肝脏再生机制因受到大规模细胞死亡和随后持续性炎症的影响而变得复杂。在APAP肝损伤后，这些过程及其相关的信号介质会复杂地调控肝再生。近期研究^［5］表明，与健康肝脏相比，在APAP毒性环境下肝再生的启动及其基本机制存在很大差异。此外，其他潜在的病理条件，如酒精性或非酒精性脂肪性肝病，也可能影响肝再生过程。与正常肝脏部分切除后的肝再生反应不同的是，在APAP肝损伤的情况下，存在与损伤相关的因素可以阻碍细胞增殖^［6］。因此，在APAP诱导的肝损伤模型中研究肝再生机制是近年来的研究重点和热点之一。

2.   APAP肝损伤后肝再生过程中剂量依赖的特点

肝脏暴露于有害化学毒物后会产生一种补偿性反应，称为代偿性肝细胞增殖或肝再生^［7］。这些毒物能导致肝脏不同区域、不同程度的受损，包括中央小叶肝毒物（如四氯化碳、硫代乙酰胺和APAP）以及周围小叶肝毒物（如丙烯醇）^［6-9］。正常生理状态下肝脏大小的调节，特别是在代偿性再生过程中的这种现象被称为肝稳态。对肝再生的剂量-反应特性研究^［6，9］表明，在达到阈值剂量之前随着毒物剂量的增加，肝再生与肝损伤呈比例增加，但是肝再生反应的起始也会逐渐延迟。然而，逐渐增加的肝再生反应最终会抵消再生反应的延迟，从而使肝损伤消退和康复。但超过这个阈值剂量后，随着剂量的进一步增加，肝再生反应急剧下降和延迟，导致肝脏出现不可逆转的损伤，最终导致康复失败和死亡^［6-7］。在小鼠中，中等毒性剂量的APAP（300 mg/kg）会导致广泛的肝损伤，同时也会引发强烈的补偿性肝再生，最终导致损伤的消退和康复；严重的APAP过量（600 mg/kg）会导致小鼠中相似的初始肝损伤，但后续的肝再生则受到严重的阻碍和延迟，导致损伤不受控制和康复失败^［7］。因此，分别使用中等毒性和严重毒性剂量的APAP模型来同时研究肝损伤与肝再生机制显得尤为重要。

3.   APAP肝损伤后的肝再生涉及多种信号分子和再生通路

3.1   细胞因子与丝裂原

APAP肝损伤之后的肝再生反应是在两种关键丝裂原和多种细胞因子的复杂调控中进行的^［10］。生长因子如肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）被认为是肝脏的主要丝裂原，可以单独在无血清的培养基中诱导肝细胞的增殖。细胞因子则被认为是肝脏的辅助丝裂原，单独在体内或体外不能诱导肝细胞增殖。此外，EGF受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和HGF受体（hepatocyte growth factor receptor，HGFR/c-MET）是已知能促进肝再生的细胞膜受体，在部分肝切除后敲除这些关键信号分子将完全抑制肝再生反应^［10-12］。氯原酸能激活EGR1的转录，从而促进APAP肝损伤后的肝再生与修复^［13］。抑制其他上游信号通路只会导致部分肝切除后发生肝再生反应的延迟，但最终肝脏会再生以恢复肝功能平衡。肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF4α）对于肝脏维持正常的发育和分化表型至关重要。Kotulkar等^［14］发现HNF4α可与核因子类胡萝卜素2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）相互作用，促进GSH补充，进而有助于APAP诱导的肝损伤恢复。

在小鼠过量注入APAP后，c-MET和EGFR都会被大量激活，并呈现APAP剂量依赖性^［7］。注入APAP后30 min内，EGFR就会被激活，并持续激活长达96 h^［7，15］。晚期给予EGFR抑制剂不仅会损害肝再生，有的小鼠在中等毒性剂量的APAP（300 mg/kg）损伤下会出现康复延迟和显著死亡的情况，这预示着康复期间的EGFR激活可能对于加速再生反应至关重要。相反，在损伤起始阶段（在损伤发展之前）给予EGFR抑制剂可显著减轻小鼠APAP过量后的肝损伤^［15］。c-MET在小鼠APAP过量后也会在早期（在3 h内）被激活，但其在APAP诱导的ALF模型中对肝再生的因果作用尚未被探讨^［7］。

鉴于HGF和EGF分子在APAP过量服用后的病理条件下对肝再生的及时启动起至关重要的作用，笔者猜想，基于HGF和EGF分子的化学类似物、嵌合物以及分子-受体结合物，有望在临床上为APAP过量摄入引发的急性肝损伤患者提供新的治疗策略。

3.2   细胞因子通路

在APAP模型中，细胞因子信号通路（TNF-α/NF-κB和IL-6/STAT3）的作用在基因敲除小鼠中已有广泛研究。在过量APAP处理后，小鼠肝脏中的TNF-α和IL-6表达水平都会增加^［7，16］。小鼠中肿瘤坏死因子受体1（tumour necrosis factor receptor 1，TNFR1）和IL-6的缺失将导致APAP肝损伤后肝再生的受损，在IL-6敲除小鼠中重新给予IL-6会导致肝再生反应的恢复^［17］。小鼠在中等毒性剂量的APAP处理后，TNF-α/NF-κB信号通路被激活、NF-κB的下游分子核内转位增加以及其与核心细胞周期基因（如控制进入细胞周期的Cyclin D1）的启动子结合更高，进而引起强烈的肝再生反应。严重的APAP过量处理后，TNF-α/NF-κB信号通路的激活明显受到抑制，导致肝再生的受损^［7］。在IL-6/STAT3通路中，IL-6首先通过与其受体复合物结合发出信号，该受体复合体由IL-6受体和信号亚基糖蛋白130（Glycoprotein 130，gp130）组成。随后Janus激酶1 将gp130细胞质尾部的酪氨酸残基进行磷酸化，向其募集信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）。STAT3磷酸化后易位到细胞核中并调节各种促有丝分裂基因的表达。在APAP过量的小鼠中，IL-6/STAT-3信号通路的激活呈剂量依赖性增高^［7］。然而，在严重过量的APAP小鼠中，即使该通路过度激活也未能导致强烈的肝再生反应，提示仅凭单一的IL-6/STAT-3信号通路可能并不足以启动强烈的肝再生^［7］。值得注意的是，TNFR1敲除小鼠在APAP过量处理后肝再生反应受损，这可能与STAT-3磷酸化延迟有关。这表明APAP肝损伤后的肝再生过程中TNF-α/NF-κB和IL-6/STAT-3信号通路存在相互作用^［18］。

3.3   其他关键信号通路

除了生长因子和细胞因子信号通路外，Wnt/β-连环蛋白信号在肝细胞增殖和肝再生过程中同样发挥重要作用^［10］。与TNF-α/NF-κB信号通路类似，在低剂量APAP过量小鼠模型中，β-连环蛋白信号通路被高度激活，但在高剂量下该过程被显著抑制^［7］。β-连环蛋白信号通路的激活与ALF患者更高的肝再生和生存率相关^［4］。通过敲除β-连环蛋白来研究其在APAP损伤后肝再生中发挥的作用一直未能成功，因为这些敲除小鼠中的细胞色素P45D 2E1（cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1，CYP2E1）表达非常低，而CYP2E1是参与APAP代谢活化的主要酶。因此，与野生型（wild type，WT）小鼠相比，β-连环蛋白敲除小鼠表现出较轻的肝损伤^［4］。然而，在上述2种小鼠中使用不同剂量的APAP以实现相等的肝损伤（即等毒剂量策略）时，肝脏中的β-连环蛋白被敲除后会导致肝再生受损，而过表达β-连环蛋白则会显著刺激肝再生^［4，7］。糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）是β-连环蛋白的上游抑制剂。GSK3抑制剂已经被用于开发治疗APAP诱导的ALF。严重的APAP过量后，通过抑制GSK3来激活β-连环蛋白信号通路只会在早期出现再生反应，但不会显著影响再生反应的峰值或整体生存结局^［19］。

近年来Hippo/YAP信号通路也被认为是肝细胞增殖和肝脏大小的关键调控因子^［10］。在APAP肝损伤中，YAP似乎产生了相反的效应，肝细胞特异性YAP缺失导致小鼠在APAP肝损伤后肝细胞增殖更快，康复迅速^［20］。mTOR信号传导通路同样是参与肝再生的重要途径之一。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）被认为是mTOR复合物2（mTOR complex 2，mTORC2）的主要底物，mTORC2一旦激活就在S473或S474位置磷酸化AKT。PI3K/AKT/mTOR通路在部分肝切除术后被显著激活^［21］。根据部分肝切除模型的研究，一些内源性物质如胆汁酸和激素也有可能调控APAP肝损伤后的肝再生^［22-23］。

4.   抑制APAP肝损伤后肝再生过程的通路机制

研究^［7］发现，在小鼠接受严重过量的APAP后，尽管许多关键的再生信号通路仍然保持高度激活，但肝再生仍然严重受损。例如，由HGF/c-MET和EGF/EGFR信号通路介导的主要丝裂原信号在严重APAP过量后更活跃，但此时肝再生反应并未相应的激活^［7，14］。可能的解释是，在小鼠严重APAP过量后，肝细胞未能对这些增殖信号作出反应^［7］。这表明可能存在抑制细胞周期的介质，在严重APAP过量情况下使得细胞周期停滞，最终导致肝再生受损。尽管抑制细胞周期的激活对于平衡再生反应和DNA修复非常重要，但在严重APAP过量后，这些通路的过度激活可能导致肝再生受损。已有研究显示，在小鼠严重APAP过量后，关键细胞周期抑制因子如p21和p53会发生显著激活^［7，24］，而p21和p53的敲除会导致小鼠在APAP过量后的肝再生反应变得更强或更快^［25-26］。另外，在坏死区域周围过多的双链DNA损伤和有限的DNA修复通路激活可能是严重APAP过量后细胞周期停滞信号激活的原因之一^［23］。临床相关性研究^{［25，27］}显示，在APAP诱导的ALF患者中，肝DNA损伤、p21等细胞周期抑制因子的表达增加与肝再生反应受损之间存在关联。转化生长因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）是p21重要的上游信号通路之一，严重APAP过量后能在坏死区域中诱导p21。在小鼠中敲除TGF-β1基因或使用TGF-β受体1抑制剂可以降低p21的表达并改善肝再生/存活。在上述研究中，巨噬细胞被发现是TGF-β的重要来源，激活了抗增殖效应^［25］，因此，TGF-β1抑制剂可能是在APAP过量后刺激再生的潜在治疗选择。整合素相关激酶（integrin-linked kinase，ILK）的细胞外基质信号转导对肝细胞的抗增殖效应、维持静止状态以及终止部分肝切除后的肝再生反应非常重要^［28］。在APAP过量损伤模型中，ILK对肝细胞增殖和肝再生产生抑制作用，而肝特异性ILK敲除可导致肝细胞增殖显著增加^［29］。

5.   APAP肝损伤后的肝再生涉及复杂的肝实质细胞和非实质细胞之间的相互作用

在肝再生过程中，肝脏内不同细胞类型之间的相互作用对APAP肝损伤后的有效再生至关重要^{［10，30］}。HGF是肝细胞的一个主要初级丝裂原，主要来自肝星状细胞的合成。在小鼠APAP肝损伤中，耗竭星状细胞或用星状细胞来源的特制培养基处理肝细胞分别产生了抑制或改善肝细胞增殖/肝再生的两种相反效果^［31-32］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）也可以刺激内皮细胞合成HGF。使用VEGF抑制剂或在小鼠中敲除VEGF受体1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR-1）会导致APAP肝损伤后肝细胞的增殖受损，而使用重组VEGF则会导致增殖增加^{［6，33-34］}。另外，肝脏内的驻留巨噬细胞可以通过诱导趋化因子受体2来促进肝细胞的增殖^［5］。最近的一项研究^［35］进一步表明巨噬细胞具有促进肝细胞增殖和治疗APAP诱导的肝损伤的潜在作用。单细胞RNA测序研究全面揭示了各种肝脏细胞类型之间的协调和分区响应在APAP肝损伤后的肝再生和维持基本肝功能方面的重要性^［36］。

6.   结语

综上所述，及时并有效的肝再生是APAP肝损伤后最终康复的决定因素。肝再生反应的程度取决于最初的肝损伤程度，任何改变最初肝损伤的干预措施都可能间接影响肝再生。APAP过量后的肝再生是由多种细胞因子、生长因子和各种信号通路的激活来共同协调的。此外，肝实质细胞和非实质细胞之间的联系对再生反应也至关重要。APAP肝毒性后肝再生和恢复过程的总结如图1所示。APAP过量后的肝再生是一种剂量依赖性的代偿性反应，剂量越高肝再生反应越迅速且强烈。调节肝再生的机制在不同的APAP剂量下差异很大，严重的APAP过量后会出现抗增殖信号通路的过度激活。因此，使用APAP模型进行肝再生研究时，考虑肝再生的剂量-反应特性非常重要。另外，即使再严重的肝损伤也可以启动肝再生，所以再生疗法对于晚期APAP诱导的ALF患者尤为重要。

图  1  APAP诱导肝毒性后肝再生过程的机制图

Figure  1.  Mechanism diagram of liver regeneration following APAP -hepatotoxicity

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