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驱动蛋白家族成员15(KIF15)对肝细胞癌增殖能力的影响及其作用机制

仇建南 汪鹏 曹胤 王忠夏 吴俊华 江春平

仇建南, 汪鹏, 曹胤, 等. 驱动蛋白家族成员15(KIF15)对肝细胞癌增殖能力的影响及其作用机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2024, 40(2): 327-334. DOI: 10.12449/JCH240217.
引用本文: 仇建南, 汪鹏, 曹胤, 等. 驱动蛋白家族成员15(KIF15)对肝细胞癌增殖能力的影响及其作用机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2024, 40(2): 327-334. DOI: 10.12449/JCH240217.
QIU JN, WANG P, CAO Y, et al. Effect of kinesin family member 15 on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells and its mechanism of action[J]. J Clin Hepatol, 2024, 40(2): 327-334. DOI: 10.12449/JCH240217.
Citation: QIU JN, WANG P, CAO Y, et al. Effect of kinesin family member 15 on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells and its mechanism of action[J]. J Clin Hepatol, 2024, 40(2): 327-334. DOI: 10.12449/JCH240217.

驱动蛋白家族成员15(KIF15)对肝细胞癌增殖能力的影响及其作用机制

DOI: 10.12449/JCH240217
基金项目: 

国家自然科学基金 (81972888)

伦理学声明:本研究方案于2016年5月7日经由南京大学医学院附属鼓楼医院动物保护与福利委员会批准,批号:2016-057-01,符合实验室动物管理与使用准则。
利益冲突声明:本文不存在任何利益冲突。
作者贡献声明:仇建南负责实验设计与操作,并撰写论文;汪鹏、曹胤、王忠夏负责数据分析和文章润色;江春平、吴俊华提供课题思路,指导实验内容,审阅最终文稿。
详细信息
    通信作者:

    江春平, chunpingjiang@126.com (ORCID: 0000-0001-8256-5731)

Effect of kinesin family member 15 on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells and its mechanism of action

Research funding: 

National Natural Science Foundation of China (81972888)

More Information
  • 摘要:   目的  探究驱动蛋白家族成员15(KIF15)对肝细胞癌(HCC)增殖能力的影响及其作用机制。  方法  通过分析TCGA和GEPIA数据集确定KIF15在HCC中的表达情况以及对肿瘤分期、生存的影响。采用qRT-PCR和Western Blot检测体外培养的人源HCC细胞系(HepG2、Hep3B、MHCC-97H和LM3)与人正常肝细胞系L02细胞的KIF15表达水平,并选择Hep3B和HepG2进行后续研究。通过对Hep3B慢病毒转染sh-NC/sh-KIF15和对HepG2慢病毒转染LV-vector/LV-KIF15进行CCK-8、平板克隆和EdU染色实验评估细胞的活力和增殖能力。GSEA分析KIF15与HCC相关的作用信号通路并通过Western Blot进行检测。计量资料两组间比较采用成组t检验;多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。  结果  TCGA和GEPIA数据集分析结果显示KIF15在HCC患者癌组织中的表达明显高于正常组织,并且KIF15与HCC分期成正比,KIF15高表达的HCC患者的生存更差。与sh-NC-Hep3B相比,sh3-Hep3B的KIF15 mRNA水平和蛋白水平均下降(P值均<0.05);与sh-NC-Hep3B相比,sh3-Hep3B的细胞活力、克隆形成数和EdU阳性率均显著降低(P值均<0.05)。与vector-HepG2相比,LV-KIF15-HepG2的KIF15 mRNA水平和蛋白水平均升高(P值均<0.05);与vector-HepG2相比,LV-KIF15-HepG2的细胞活力、克隆形成数和EdU阳性率均提高(P值均<0.05)。皮下瘤实验结果显示:与sh-NC-Hep3B相比,sh3-Hep3B的瘤体积和瘤重量降低;Ki67的组化评分降低,而TUNEL的组化评分提高(P值均<0.05)。GSEA分析显示在HCC中PI3K/AKT/mTOR通路与KIF15呈正相关(NES=1.59,P<0.001),Western Blot检测发现LY294002能够抑制LV-KIF15-HepG2中上调的PI3K/AKT/mTOR通路,与LV-KIF15-HepG2相比,LY294002+LV-KIF15-HepG2的细胞活力、克隆形成数和EdU阳性率降低(P值均<0.05)。  结论  KIF15通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路增强HCC的活力和增殖能力。

     

  • 肝细胞癌(HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内的发病率不断上升。尽管肝部分切除术和肝移植术是目前主要的治疗手段,但是很多患者确诊时已经丧失了手术机会,预后较差。虽然HCC的治疗已经取得一些新的进展,比如靶向药物治疗、免疫治疗等1-2。但是HCC发生发展的机制仍然需要进一步深入探究。

    驱动蛋白家族成员15(KIF15)具有四聚体纺锤马达结构,其马达结构域结构以ATP样构型,颈部接头与催化核心对接;通过水解ATP为多种物质的运输提供能量3-4。KIF15在肿瘤中的作用被广泛报道,例如KIF15通过激活Raf/MEK/ERK通路促进非小细胞肺癌的恶性进展5;KIF15上调促进泛素特异性蛋白酶15(USP15)介导的DEK去泛素化导致平滑肌肉瘤细胞生长6;KIF15通过抑制活性氧介导的细胞凋亡促进胃癌进展7。目前,KIF15在HCC中的作用尚不确切,因此本研究旨在探究KIF15在HCC中的潜在作用机制,为HCC的治疗提供新思路。

    人正常肝细胞L02,人HCC细胞株HepG2、LM3、MHCC-97H和Hep3B(中国科学院细胞库);KIF15过表达慢病毒(LV-KIF15)和对应的阴性对照(vector),KIF15敲低慢病毒(sh-KIF15)和对应的阴性对照(shNC)及相应的转染试剂HiTransG A/P(上海吉凯生物有限公司);Trizol试剂(美国Thermo Fisher公司);逆转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒与CCK8试剂(诺唯赞生物科技有限公司);抑制剂LY294002(MCE公司);EDU试剂盒(锐博生物有限公司);Western Blot试剂盒(碧云天有限公司)。本研究中抗体包括KIF15、GAPDH、p-PI3K(Tyr458)、PI3K、AKT、p-AKT(Ser473)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)。DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);胰蛋白酶(新赛美公司);青链霉素双抗(上海翊圣生物科技有限公司)。

    1.2.1   细胞培养

    使用DMEM(含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)培养人HCC细胞株HepG2、LM3、MHCC-97H、Hep3B和正常肝细胞L02,放于37 °C含5% CO2的加湿培养箱中培养。每2天换液1次,当细胞生长汇合率超过85%时,胰蛋白酶消化后分皿传代培养。

    1.2.2   慢病毒转染

    将Hep3B和HepG2培养至状态良好,按每孔100万接种于6孔板中,进行慢病毒转染。Hep3B转染针对KIF15的干扰慢病毒LV-shKIF15(sh1、sh2和sh3)以及对照(sh-NC);HepG2转染编码KIF15的慢病毒载体(LV-KIF15)以及对照(vector)。使用吉凯公司助转染试剂提高转染效率。培养2天后用含嘌呤霉素(2.5 μg/mL)的DMEM筛选培养。

    1.2.3   qRT-PCR实验

    将相应的HCC细胞培养至状态良好后收集,采用Trizol试剂提取细胞的总RNA,然后合成cDNA的反应混合物为20 μL/孔,由1 μg总RNA和4 μL 5×HiScript ‍Ⅱ‍qRT SuperMix及无RNase的ddH2O组成。qRT-PCR的反应体系为:1 μL cDNA、5 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix、0.2 μL上游引物、0.2 μL下游引物和3.6 μL DEPC水。设定程序:95 ℃、10 min;95 ℃、15 s, 60 ℃、30 s,72 ℃、10 s,40个循环。KIF15 mRNA的相对表达量按2-ΔΔCt法计算。

    1.2.4   CCK-8实验

    将稳定转染的HCC细胞种在96孔板(500个细胞/孔)中,分别于第1、2、3、4、5天相同时间,在每个孔加入CCK-8溶液(10 μL/孔),在培养箱中孵育2 h后,使用酶标仪测量每孔在450 nm处的吸光度(OD)值。

    1.2.5   平板克隆实验

    将培养的相应的HCC细胞按每孔500个/2 mL培养基密度接种于6孔板中,连续培养14天,弃掉培养基,PBS洗涤后用4%多聚甲醛固定细胞10 min,弃掉多聚甲醛后每个孔加入2 mL结晶紫染液,避光染色30 min后,PBS洗涤,等待自然干燥后,肉眼计数克隆形成的数目。

    1.2.6   EdU实验

    将稳定转染的细胞株接种于96孔板(2×104个细胞/孔)中,用DMEM培养1天。然后,在37 ℃下用50 μmol/L的EdU孵育2 h。再用4%的甲醛溶液固定细胞30 min,然后用0.5%的TritonX-100渗透细胞株10 min。加入400 μL 1×ApolloR反应物,再加入400 μL Hoechest33342,PBS冲洗3次后观察EdU阳性细胞。最后通过显微镜拍摄细胞的图像。

    1.2.7   Western Blot实验

    收集Hep3B和HepG2细胞,加入包含PMSF和磷酸酶蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞30 min。收集蛋白样品并检测其浓度。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE(10%)凝胶电泳75 min,继而进行转膜。使用Western Blot快速封闭液室温孵育30 min。将条带置于相应一抗(1∶1 000)中4 ℃摇床上孵育过夜。第二天用TBST洗膜3次,每次10 min。然后将条带置于特异性二抗(1∶2 000)室温孵育2 h后,再次TBST洗膜3次,每次10 min。天能凝胶成像仪显影蛋白条带。Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。

    1.2.8   动物实验

    将稳定转染的sh-NC/sh3 Hep3B细胞培养至状态良好,按1×106个细胞/100 μL PBS的密度重悬,接种于4周龄雌性BALB/c裸鼠的皮下,每组3只裸鼠,皮下注射肿瘤细胞。28天后摘下皮下瘤,计算肿瘤体积与肿瘤重量。将瘤块石蜡包埋、切片和脱蜡,分别进行Ki67和TUNEL染色。实验鼠购自扬州大学比较医学中心,实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2022-0009,实验动物使用许可证号:SYXK(苏)2022-0034。

    1.2.9   生物信息学分析

    使用TCGA-LIHC数据集分析KIF15在HCC中的表达情况以及表达高低对临床预后的影响。GEPIA数据库分析KIF15在HCC中与肿瘤分期的关系以及对预后的影响。

    1.2.10   GSEA分析

    为了在TCGA-HCC数据集中研究与KIF15相关的潜在信号途径,故进行GSEA分析。首先,基于与KIF15表达的相关性,生成TCGA-HCC的FPKM转录数据中所有基因的有序列表。然后选择参考基因集“h.all.v6.2.entrez.Gmt”进行分析,最后使用GSEA软件(v2.10.1)分析KIF15高、低表达组之间的基因富集情况。

    采用SPSS 21.0软件进行数据统计分析。计量资料以x¯±s表示,两组间比较采用成组t检验;多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    通过分析TCGA-LIHC数据集中KIF15的表达,发现在HCC癌组织中KIF15的表达量显著高于正常肝组织(P<0.05)(图1a、b);GEPIA数据集分析发现,KIF15与HCC病理学分期呈正相关(P<0.05)(图1c);qRT-PCR和Western Blot分析发现KIF15在HCC细胞株中表达增高,同时选取表达量最高Hep3B细胞株和较低的HepG2细胞株做后续探究(P<0.05)(图1d、e,表1)。

    注: a、b为TCGA数据集中KIF15在HCC中的表达;c为TCGA数据集中KIF15与HCC分期的关系;d、e为qRT-PCR和Western Blot分析KIF15在HCC细胞株中的表达情况,与L02组比较,*P<0.001;f、g为TCGA和GEPIA数据集中KIF15表达与HCC生存的关系。
    图  1  KIF15在HCC中的相对表达情况和对生存率的影响
    Figure  1.  The relative expression of KIF15 in hepatocellular carcinoma and its effect on survival rate
    表  1  Western Blot 检测KIF15蛋白在HCC细胞株中的表达水平
    Table  1.  The protein expression level of KIF15 in HCC cell lines by Western Blot
    组别 KIF15
    L02 1.00±0.02
    HepG2 1.45±0.101)
    LM3 5.22±0.391)
    MHCC-97H 3.49±0.251)
    Hep3B 7.69±0.611)
    F 192.40
    P <0.001
    注:与L02组比较,1)P<0.05。
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    通过分析TCGA-LIHC数据集中KIF15与HCC的生存关系,发现KIF15高表达的患者生存率显著低于KIF15低表达者(P<0.05)(图1f);分析GEPIA数据集中KIF15与HCC的生存关系,亦发现KIF15高表达的患者生存率显著低于KIF15低表达者(P<0.05)(图1g)。综上,KIF15在HCC中表达增高,且高表达患者生存更差。

    通过转染慢病毒敲低Hep3B细胞株中KIF15的表达量,qRT-PCR和Western Blot实验分析发现sh3慢病毒的敲低效率最高,与sh-NC-Hep3B相比,sh3-Hep3B细胞的KIF15 mRNA(0.17±0.05 vs 0.99±0.03,P<0.001)和蛋白水平(P<0.05)均显著下降(图2a,表2),并选择sh3-Hep3B细胞用于后续研究。其次,对转染慢病毒过表达HepG2细胞株中KIF15的表达量,通过qRT-PCR和Western Blot实验分析发现,与vector-HepG2相比,LV-KIF15-HepG2的KIF15 mRNA水平(11.37±1.17 vs 1.00±0.13,P<0.001)和蛋白水平(6.12±0.23 vs 0.99±0.06,P<0.001)均升高(图2b)。通过CCK-8实验分析发现,与sh-NC-Hep3B相比,sh3-Hep3B的细胞活力受到抑制(0.765±0.104 vs 1.560±0.135,P<0.05)(图2c);而与vector-HepG2相比,LV-KIF15-HepG2的细胞活力显著增强(1.664±0.133 vs 1.056±0.123,P<0.05)(图2c)。通过GEPIA数据集分析显示,KIF15在HCC中与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达呈正相关(P<0.05)(图2d),提示KIF15对于HCC增殖能力可能存在促进作用。

    注: a,qRT-PCR验证Hep3B细胞中敲低KIF15的效率,与sh-NC比较,*P<0.01;b,qRT-PCR验证HepG2细胞中过表达KIF15的效率;c,CCK-8实验分析Hep3B和HepG2细胞增殖活力;d,GEPIA数据集中KIF15在HCC中的表达与PCNA的相关性;e、f,克隆形成实验分析Hep3B和HepG2细胞克隆数;g、h,EdU实验分析Hep3B和HepG2细胞增殖能力。
    图  2  KIF15对HCC增殖能力的影响
    Figure  2.  Effect of KIF15 on proliferation of hepatocellular carcinoma
    表  2  Western Blot 检测KIF15蛋白在Hep3B中的表达水平
    Table  2.  The protein expression level of KIF15 in Hep3B by Western Blot
    分组 KIF15
    sh-NC 1.00±0.08
    sh1 0.54±0.141)
    sh2 0.66±0.081)
    sh3 0.15±0.051)
    F 41.63
    P <0.001
    注:与sh-NC组比较,1)P<0.05。
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    通过克隆形成实验分析发现,与sh-NC-Hep3B相比,sh3-Hep3B的克隆形成数显著减少(51.67±6.03 vs 118.33±11.59,P<0.001)(图2e);而与vector-HepG2相比,LV-KIF15-HepG2的克隆形成数显著增多(172.00±7.55 vs 74.67±7.57,P<0.001)(图2f)。同时EdU染色实验显示,与sh-NC-Hep3B相比,sh3-Hep3B的EdU阳性率显著降低[(14.33±2.08)% vs (28.67±2.08)%,P<0.01](图2g);而与vector-HepG2相比,LV-KIF15-HepG2的EdU阳性率显著升高[(28.67±1.53)% vs (15.00±1.73)%,P<0.001](图2h)。综上,KIF15能够促进HCC的增殖能力。

    通过构建皮下瘤生长模型,探究KIF15对于HCC体内生长的影响。将稳定转染并生长状态良好的Hep3B细胞株(sh-NC/sh3)按照每100 μL中1×106个细胞的数量,接种于裸鼠皮下,造模后皮下瘤瘤体见图3a。研究结果显示,与sh-NC-Hep3B细胞相比,sh3-Hep3B细胞皮下瘤体积[(350.00±100.00)mm3 vs (1 046.67±105.03)mm3P<0.001]和重量[(366.67±110.15)mg vs (1 166.67±76.38)mg,P<0.001]均显著降低(图3b、c)。对皮下瘤进行免疫组化染色发现,sh3-Hep3B细胞皮下瘤Ki67的组化评分显著低于转染sh-NC-Hep3B的皮下瘤(2.33±0.58 vs 7.33±1.15,P<0.01)(图3d);而转染sh3-Hep3B细胞皮下瘤TUNEL的组化评分显著高于sh-NC-Hep3B细胞的皮下瘤(5.33±1.15 vs 1.33±0.58,P<0.01)(图3e),提示敲低KIF15抑制了Hep3B皮下瘤的增殖能力,而增强了凋亡水平。综上,敲低KIF15能够抑制HCC的体内生长能力。

    注: a,造模后皮下瘤瘤体照片;b,瘤体的体积;c,瘤体的重量;d、e,免疫组化染色分析Hep3B(sh-NC/sh3)瘤体组织中Ki67和TUNEL表达情况。
    图  3  KIF15对HCC体内生长能力的影响
    Figure  3.  Effect of KIF15 on the growth capacity of hepatocellular carcinoma in vivo

    通过GSEA分析KIF15在HCC中发挥作用的潜在机制,发现KIF15与PI3K/AKT/mTOR通路呈正相关(NES=1.59,P<0.001)(图4a)。Western Blot实验结果表明,与sh-NC-Hep3B细胞相比,sh3-Hep3B细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路受到显著抑制(P值均<0.001)(图4b,表3);而与vector组相比,过表达KIF15能够促进HepG2细胞的PI3K/AKT/mTOR信号通路显著增强(P值均<0.001)(图4c,表4);此外,PI3K抑制剂LY294002能够抑制LV-KIF15-HepG2细胞中的PI3K/AKT/mTOR信号通路(图4d,表5)。CCK-8实验结果表明,当LY294002抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路后,LY294002+LV-KIF15-HepG2细胞的活力较LV-KIF15-HepG2细胞明显下降(1.084±0.118 vs 1.670±0.102,P<0.01)(图4e)。平板克隆实验结果显示,相较于LV-KIF15-HepG2细胞,LY294002处理后的LV-KIF15-HepG2细胞的克隆形成能力受到显著抑制(78.33±7.64 vs 161.67±17.56,P<0.01)(图4f)。EdU染色实验显示,相较于LV-KIF15-HepG2细胞,LY294002处理后的LV-KIF15-HepG2细胞的EdU阳性率显著降低[(18.61±1.24)% vs (28.54±3.83)%,P<0.05](图4g)。综上,KIF15通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进HCC的增殖能力。

    注: a,GSEA分析KIF15在HCC中潜在的作用通路;b,Western Blot验证Hep3B细胞中PI3K/AKT/mTOR通路表达情况;c、d,Western Blot验证HepG2细胞中PI3K/AKT/mTOR通路表达情况;e,CCK-8实验分析HepG2细胞增殖活力;f,克隆形成实验分析HepG2细胞克隆数;g,EdU实验分析HepG2细胞增殖活力。
    图  4  KIF15对HCC增殖能力影响的机制探究
    Figure  4.  The mechanism of the effect of KIF15 on the proliferation of hepatocellular carcinoma
    表  3  Western Blot 检测Hep3B细胞中相关蛋白表达结果
    Table  3.  Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in Hep3B cells
    分组 KIF15 p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR
    sh-NC 1.05±0.10 0.99±0.06 0.99±0.06 0.98±0.07
    sh3 0.19±0.03 0.14±0.04 0.24±0.05 0.22±0.02
    t 13.88 19.66 16.71 17.48
    P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
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    表  4  Western Blot 检测HepG2细胞中相关蛋白表达结果
    Table  4.  Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in HepG2 cells
    分组 KIF15 p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR
    vector 1.00±0.06 1.04±0.10 1.02±0.06 0.96±0.04
    KIF15 6.12±0.20 5.11±0.22 4.56±0.49 4.56±0.55
    t 41.97 29.29 12.46 11.24
    P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
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    表  5  LY294002抑制剂干预对HepG2细胞中相关蛋白表达的影响
    Table  5.  The effect of inhibitor LY294002 intervention on the expression of related proteins in HepG2 cells
    分组 KIF15 p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR
    vector 1.06±0.13 1.01±0.09 0.96±0.08 0.97±0.05
    KIF15 5.68±0.35 4.64±0.57 4.70±0.51 4.82±0.37
    KIF15+LY294002 5.42±0.251) 1.17±0.091) 1.07±0.121) 1.22±0.101)
    F 301.05 111.64 145.32 284.41
    P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
    注:与KIF15组比较,1)P<0.05。
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    肝癌发病率和死亡率位列全球恶性肿瘤第6位和第4位,预计到2040年全球将有140万肝癌患者,且将有130万人死于肝癌8。目前HCC的主要治疗方法是手术、介入、化疗和免疫治疗等,但是患者的复发率仍然较高,5年生存率仅约20%9-11。因此,探究HCC发生和发展的机制,对HCC的诊治将提供重要的理论基础。

    KIF15,又名kinesin-12,是一种微管相关蛋白,其功能是微管依赖转运或纺锤体组织的调节因子12-13。已有大量研究14-15揭示了KIF15在多种肿瘤中的作用。在胰腺癌中,KIF15通过招募USP10和磷酸甘油酸激酶1增强胰腺癌细胞的糖酵解能力,从而增强其恶性程度16;敲低KIF15后,胶质瘤的增殖能力受到抑制17;此外,KIF15在鼻咽癌组织中高表达,与鼻咽癌预后不良相关,敲低KIF15将抑制鼻咽癌细胞株的增殖和倾袭能力18。在前列腺癌中,KIF15通过增强前列腺癌细胞的雄激素受体(AR)信号通路来促进恩杂鲁胺耐药;机制上,KIF15直接结合AR/AR-v7的N端,通过增加USP14与AR/AR-v7的蛋白结合,阻止AR/AR-v7蛋白的降解19。HCC作为恶性程度较高的常见肿瘤,KIF15对HCC的作用尚不明确。

    本研究通过分析TCGA和GEPIA数据库发现KIF15在HCC组织中表达显著增高,且KIF15高表达与HCC不良预后相关。通过qRT-PCR和Western Blot评估KIF15在HCC细胞株中的表达水平,选择HepG2过表达KIF15以及选择Hep3B敲低KIF15,验证过表达和敲低的效率后进行细胞实验的探究。结果显示,过表达KIF15导致HCC细胞株的增殖能力增强,而敲低KIF15能够抑制HCC细胞株的增殖;并且敲低KIF15能够抑制HCC的体内生长能力。上述结果表明KIF15在HCC中发挥促进增殖的促癌作用。

    已有大量研究20-22报道,PI3K/AKT/mTOR信号通路在癌症进展中发挥关键作用。TBK1通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进甲状腺癌进展23;UHMK1通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肺腺癌的发生24;STK3通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路,降低胰腺癌细胞的增殖能力,并且促进癌细胞的凋亡25。本研究通过GSEA分析发现KIF15在HCC中与PI3K/AKT/mTOR的激活呈正相关。通过Western Blot分析发现,过表达KIF15能够激活HepG2细胞的PI3K/AKT/mTOR通路,而敲低KIF15导致Hep3B细胞的PI3K/AKT/mTOR通路受到抑制。通过进一步实验发现,PI3K抑制剂LY294002能够抑制过表达KIF15的HepG2细胞中的PI3K/AKT/mTOR通路,并且导致细胞的增殖能力受到显著抑制。

    综上所述本研究证实KIF15通过激活PI3K/AKT/mTOR通路,发挥促进HCC的增殖能力,为KIF15作为肝癌的诊断标志和预后指标提供了理论依据,但是KIF15在HCC中的精确机制仍需深入探究。

  • 注: a、b为TCGA数据集中KIF15在HCC中的表达;c为TCGA数据集中KIF15与HCC分期的关系;d、e为qRT-PCR和Western Blot分析KIF15在HCC细胞株中的表达情况,与L02组比较,*P<0.001;f、g为TCGA和GEPIA数据集中KIF15表达与HCC生存的关系。

    图  1  KIF15在HCC中的相对表达情况和对生存率的影响

    Figure  1.  The relative expression of KIF15 in hepatocellular carcinoma and its effect on survival rate

    注: a,qRT-PCR验证Hep3B细胞中敲低KIF15的效率,与sh-NC比较,*P<0.01;b,qRT-PCR验证HepG2细胞中过表达KIF15的效率;c,CCK-8实验分析Hep3B和HepG2细胞增殖活力;d,GEPIA数据集中KIF15在HCC中的表达与PCNA的相关性;e、f,克隆形成实验分析Hep3B和HepG2细胞克隆数;g、h,EdU实验分析Hep3B和HepG2细胞增殖能力。

    图  2  KIF15对HCC增殖能力的影响

    Figure  2.  Effect of KIF15 on proliferation of hepatocellular carcinoma

    注: a,造模后皮下瘤瘤体照片;b,瘤体的体积;c,瘤体的重量;d、e,免疫组化染色分析Hep3B(sh-NC/sh3)瘤体组织中Ki67和TUNEL表达情况。

    图  3  KIF15对HCC体内生长能力的影响

    Figure  3.  Effect of KIF15 on the growth capacity of hepatocellular carcinoma in vivo

    注: a,GSEA分析KIF15在HCC中潜在的作用通路;b,Western Blot验证Hep3B细胞中PI3K/AKT/mTOR通路表达情况;c、d,Western Blot验证HepG2细胞中PI3K/AKT/mTOR通路表达情况;e,CCK-8实验分析HepG2细胞增殖活力;f,克隆形成实验分析HepG2细胞克隆数;g,EdU实验分析HepG2细胞增殖活力。

    图  4  KIF15对HCC增殖能力影响的机制探究

    Figure  4.  The mechanism of the effect of KIF15 on the proliferation of hepatocellular carcinoma

    表  1  Western Blot 检测KIF15蛋白在HCC细胞株中的表达水平

    Table  1.   The protein expression level of KIF15 in HCC cell lines by Western Blot

    组别 KIF15
    L02 1.00±0.02
    HepG2 1.45±0.101)
    LM3 5.22±0.391)
    MHCC-97H 3.49±0.251)
    Hep3B 7.69±0.611)
    F 192.40
    P <0.001
    注:与L02组比较,1)P<0.05。
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    表  2  Western Blot 检测KIF15蛋白在Hep3B中的表达水平

    Table  2.   The protein expression level of KIF15 in Hep3B by Western Blot

    分组 KIF15
    sh-NC 1.00±0.08
    sh1 0.54±0.141)
    sh2 0.66±0.081)
    sh3 0.15±0.051)
    F 41.63
    P <0.001
    注:与sh-NC组比较,1)P<0.05。
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    表  3  Western Blot 检测Hep3B细胞中相关蛋白表达结果

    Table  3.   Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in Hep3B cells

    分组 KIF15 p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR
    sh-NC 1.05±0.10 0.99±0.06 0.99±0.06 0.98±0.07
    sh3 0.19±0.03 0.14±0.04 0.24±0.05 0.22±0.02
    t 13.88 19.66 16.71 17.48
    P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
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    表  4  Western Blot 检测HepG2细胞中相关蛋白表达结果

    Table  4.   Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in HepG2 cells

    分组 KIF15 p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR
    vector 1.00±0.06 1.04±0.10 1.02±0.06 0.96±0.04
    KIF15 6.12±0.20 5.11±0.22 4.56±0.49 4.56±0.55
    t 41.97 29.29 12.46 11.24
    P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
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    表  5  LY294002抑制剂干预对HepG2细胞中相关蛋白表达的影响

    Table  5.   The effect of inhibitor LY294002 intervention on the expression of related proteins in HepG2 cells

    分组 KIF15 p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR
    vector 1.06±0.13 1.01±0.09 0.96±0.08 0.97±0.05
    KIF15 5.68±0.35 4.64±0.57 4.70±0.51 4.82±0.37
    KIF15+LY294002 5.42±0.251) 1.17±0.091) 1.07±0.121) 1.22±0.101)
    F 301.05 111.64 145.32 284.41
    P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
    注:与KIF15组比较,1)P<0.05。
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  • 收稿日期:  2023-05-29
  • 录用日期:  2023-07-04
  • 出版日期:  2024-02-19
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