肝细胞癌（HCC）是人类最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内的发病率不断上升。尽管肝部分切除术和肝移植术是目前主要的治疗手段，但是很多患者确诊时已经丧失了手术机会，预后较差。虽然HCC的治疗已经取得一些新的进展，比如靶向药物治疗、免疫治疗等^［1-2］。但是HCC发生发展的机制仍然需要进一步深入探究。

驱动蛋白家族成员15（KIF15）具有四聚体纺锤马达结构，其马达结构域结构以ATP样构型，颈部接头与催化核心对接；通过水解ATP为多种物质的运输提供能量^［3-4］。KIF15在肿瘤中的作用被广泛报道，例如KIF15通过激活Raf/MEK/ERK通路促进非小细胞肺癌的恶性进展^［5］；KIF15上调促进泛素特异性蛋白酶15（USP15）介导的DEK去泛素化导致平滑肌肉瘤细胞生长^［6］；KIF15通过抑制活性氧介导的细胞凋亡促进胃癌进展^［7］。目前，KIF15在HCC中的作用尚不确切，因此本研究旨在探究KIF15在HCC中的潜在作用机制，为HCC的治疗提供新思路。

1.   材料与方法

1.1   细胞株和主要试剂

人正常肝细胞L02，人HCC细胞株HepG2、LM3、MHCC-97H和Hep3B（中国科学院细胞库）；KIF15过表达慢病毒（LV-KIF15）和对应的阴性对照（vector），KIF15敲低慢病毒（sh-KIF15）和对应的阴性对照（shNC）及相应的转染试剂HiTransG A/P（上海吉凯生物有限公司）；Trizol试剂（美国Thermo Fisher公司）；逆转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒与CCK8试剂（诺唯赞生物科技有限公司）；抑制剂LY294002（MCE公司）；EDU试剂盒（锐博生物有限公司）；Western Blot试剂盒（碧云天有限公司）。本研究中抗体包括KIF15、GAPDH、p-PI3K（Tyr458）、PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）、mTOR、p-mTOR（Ser2448）。DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（新赛美公司）；青链霉素双抗（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.2   方法

1.2.1   细胞培养

使用DMEM（含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）培养人HCC细胞株HepG2、LM3、MHCC-97H、Hep3B和正常肝细胞L02，放于37 °C含5% CO₂的加湿培养箱中培养。每2天换液1次，当细胞生长汇合率超过85%时，胰蛋白酶消化后分皿传代培养。

1.2.2   慢病毒转染

将Hep3B和HepG2培养至状态良好，按每孔100万接种于6孔板中，进行慢病毒转染。Hep3B转染针对KIF15的干扰慢病毒LV-shKIF15（sh1、sh2和sh3）以及对照（sh-NC）；HepG2转染编码KIF15的慢病毒载体（LV-KIF15）以及对照（vector）。使用吉凯公司助转染试剂提高转染效率。培养2天后用含嘌呤霉素（2.5 μg/mL）的DMEM筛选培养。

1.2.3   qRT-PCR实验

将相应的HCC细胞培养至状态良好后收集，采用Trizol试剂提取细胞的总RNA，然后合成cDNA的反应混合物为20 μL/孔，由1 μg总RNA和4 μL 5×HiScript ‍Ⅱ‍qRT SuperMix及无RNase的ddH₂O组成。qRT-PCR的反应体系为：1 μL cDNA、5 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix、0.2 μL上游引物、0.2 μL下游引物和3.6 μL DEPC水。设定程序：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s， 60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，40个循环。KIF15 mRNA的相对表达量按2^-ΔΔCt法计算。

1.2.4   CCK-8实验

将稳定转染的HCC细胞种在96孔板（500个细胞/孔）中，分别于第1、2、3、4、5天相同时间，在每个孔加入CCK-8溶液（10 μL/孔），在培养箱中孵育2 h后，使用酶标仪测量每孔在450 nm处的吸光度（OD）值。

1.2.5   平板克隆实验

将培养的相应的HCC细胞按每孔500个/2 mL培养基密度接种于6孔板中，连续培养14天，弃掉培养基，PBS洗涤后用4%多聚甲醛固定细胞10 min，弃掉多聚甲醛后每个孔加入2 mL结晶紫染液，避光染色30 min后，PBS洗涤，等待自然干燥后，肉眼计数克隆形成的数目。

1.2.6   EdU实验

将稳定转染的细胞株接种于96孔板（2×10⁴个细胞/孔）中，用DMEM培养1天。然后，在37 ℃下用50 μmol/L的EdU孵育2 h。再用4%的甲醛溶液固定细胞30 min，然后用0.5%的TritonX-100渗透细胞株10 min。加入400 μL 1×ApolloR反应物，再加入400 μL Hoechest33342，PBS冲洗3次后观察EdU阳性细胞。最后通过显微镜拍摄细胞的图像。

1.2.7   Western Blot实验

收集Hep3B和HepG2细胞，加入包含PMSF和磷酸酶蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞30 min。收集蛋白样品并检测其浓度。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE（10%）凝胶电泳75 min，继而进行转膜。使用Western Blot快速封闭液室温孵育30 min。将条带置于相应一抗（1∶1 000）中4 ℃摇床上孵育过夜。第二天用TBST洗膜3次，每次10 min。然后将条带置于特异性二抗（1∶2 000）室温孵育2 h后，再次TBST洗膜3次，每次10 min。天能凝胶成像仪显影蛋白条带。Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。

1.2.8   动物实验

将稳定转染的sh-NC/sh3 Hep3B细胞培养至状态良好，按1×10⁶个细胞/100 μL PBS的密度重悬，接种于4周龄雌性BALB/c裸鼠的皮下，每组3只裸鼠，皮下注射肿瘤细胞。28天后摘下皮下瘤，计算肿瘤体积与肿瘤重量。将瘤块石蜡包埋、切片和脱蜡，分别进行Ki67和TUNEL染色。实验鼠购自扬州大学比较医学中心，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2022-0009，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2022-0034。

1.2.9   生物信息学分析

使用TCGA-LIHC数据集分析KIF15在HCC中的表达情况以及表达高低对临床预后的影响。GEPIA数据库分析KIF15在HCC中与肿瘤分期的关系以及对预后的影响。

1.2.10   GSEA分析

为了在TCGA-HCC数据集中研究与KIF15相关的潜在信号途径，故进行GSEA分析。首先，基于与KIF15表达的相关性，生成TCGA-HCC的FPKM转录数据中所有基因的有序列表。然后选择参考基因集“h.all.v6.2.entrez.Gmt”进行分析，最后使用GSEA软件（v2.10.1）分析KIF15高、低表达组之间的基因富集情况。

1.3   统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行数据统计分析。计量资料以x¯±s表示，两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   KIF15在HCC中的相对表达情况和对生存率的影响

通过分析TCGA-LIHC数据集中KIF15的表达，发现在HCC癌组织中KIF15的表达量显著高于正常肝组织（P<0.05）（图1a、b）；GEPIA数据集分析发现，KIF15与HCC病理学分期呈正相关（P<0.05）（图1c）；qRT-PCR和Western Blot分析发现KIF15在HCC细胞株中表达增高，同时选取表达量最高Hep3B细胞株和较低的HepG2细胞株做后续探究（P<0.05）（图1d、e，表1）。

注： a、b为TCGA数据集中KIF15在HCC中的表达；c为TCGA数据集中KIF15与HCC分期的关系；d、e为qRT-PCR和Western Blot分析KIF15在HCC细胞株中的表达情况，与L02组比较，*P<0.001；f、g为TCGA和GEPIA数据集中KIF15表达与HCC生存的关系。

图  1  KIF15在HCC中的相对表达情况和对生存率的影响

Figure  1.  The relative expression of KIF15 in hepatocellular carcinoma and its effect on survival rate

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表  1  Western Blot 检测KIF15蛋白在HCC细胞株中的表达水平

Table  1.  The protein expression level of KIF15 in HCC cell lines by Western Blot

组别	KIF15
L02	1.00±0.02
HepG2	1.45±0.101）
LM3	5.22±0.391）
MHCC-97H	3.49±0.251）
Hep3B	7.69±0.611）
F值	192.40
P值	<0.001
注：与L02组比较，1）P<0.05。

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通过分析TCGA-LIHC数据集中KIF15与HCC的生存关系，发现KIF15高表达的患者生存率显著低于KIF15低表达者（P<0.05）（图1f）；分析GEPIA数据集中KIF15与HCC的生存关系，亦发现KIF15高表达的患者生存率显著低于KIF15低表达者（P<0.05）（图1g）。综上，KIF15在HCC中表达增高，且高表达患者生存更差。

2.2   KIF15对HCC增殖能力的影响

通过转染慢病毒敲低Hep3B细胞株中KIF15的表达量，qRT-PCR和Western Blot实验分析发现sh3慢病毒的敲低效率最高，与sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B细胞的KIF15 mRNA（0.17±0.05 vs 0.99±0.03，P<0.001）和蛋白水平（P<0.05）均显著下降（图2a，表2），并选择sh3-Hep3B细胞用于后续研究。其次，对转染慢病毒过表达HepG2细胞株中KIF15的表达量，通过qRT-PCR和Western Blot实验分析发现，与vector-HepG2相比，LV-KIF15-HepG2的KIF15 mRNA水平（11.37±1.17 vs 1.00±0.13，P<0.001）和蛋白水平（6.12±0.23 vs 0.99±0.06，P<0.001）均升高（图2b）。通过CCK-8实验分析发现，与sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B的细胞活力受到抑制（0.765±0.104 vs 1.560±0.135，P<0.05）（图2c）；而与vector-HepG2相比，LV-KIF15-HepG2的细胞活力显著增强（1.664±0.133 vs 1.056±0.123，P<0.05）（图2c）。通过GEPIA数据集分析显示，KIF15在HCC中与增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达呈正相关（P<0.05）（图2d），提示KIF15对于HCC增殖能力可能存在促进作用。

注： a，qRT-PCR验证Hep3B细胞中敲低KIF15的效率，与sh-NC比较，*P<0.01；b，qRT-PCR验证HepG2细胞中过表达KIF15的效率；c，CCK-8实验分析Hep3B和HepG2细胞增殖活力；d，GEPIA数据集中KIF15在HCC中的表达与PCNA的相关性；e、f，克隆形成实验分析Hep3B和HepG2细胞克隆数；g、h，EdU实验分析Hep3B和HepG2细胞增殖能力。

图  2  KIF15对HCC增殖能力的影响

Figure  2.  Effect of KIF15 on proliferation of hepatocellular carcinoma

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表  2  Western Blot 检测KIF15蛋白在Hep3B中的表达水平

Table  2.  The protein expression level of KIF15 in Hep3B by Western Blot

分组	KIF15
sh-NC	1.00±0.08
sh1	0.54±0.141）
sh2	0.66±0.081）
sh3	0.15±0.051）
F值	41.63
P值	<0.001
注：与sh-NC组比较，1）P<0.05。

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通过克隆形成实验分析发现，与sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B的克隆形成数显著减少（51.67±6.03 vs 118.33±11.59，P<0.001）（图2e）；而与vector-HepG2相比，LV-KIF15-HepG2的克隆形成数显著增多（172.00±7.55 vs 74.67±7.57，P<0.001）（图2f）。同时EdU染色实验显示，与sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B的EdU阳性率显著降低［（14.33±2.08）% vs （28.67±2.08）%，P<0.01］（图2g）；而与vector-HepG2相比，LV-KIF15-HepG2的EdU阳性率显著升高［（28.67±1.53）% vs （15.00±1.73）%，P<0.001］（图2h）。综上，KIF15能够促进HCC的增殖能力。

2.3   KIF15对HCC体内生长能力的影响

通过构建皮下瘤生长模型，探究KIF15对于HCC体内生长的影响。将稳定转染并生长状态良好的Hep3B细胞株（sh-NC/sh3）按照每100 μL中1×10⁶个细胞的数量，接种于裸鼠皮下，造模后皮下瘤瘤体见图3a。研究结果显示，与sh-NC-Hep3B细胞相比，sh3-Hep3B细胞皮下瘤体积［（350.00±100.00）mm³ vs （1 046.67±105.03）mm³，P<0.001］和重量［（366.67±110.15）mg vs （1 166.67±76.38）mg，P<0.001］均显著降低（图3b、c）。对皮下瘤进行免疫组化染色发现，sh3-Hep3B细胞皮下瘤Ki67的组化评分显著低于转染sh-NC-Hep3B的皮下瘤（2.33±0.58 vs 7.33±1.15，P<0.01）（图3d）；而转染sh3-Hep3B细胞皮下瘤TUNEL的组化评分显著高于sh-NC-Hep3B细胞的皮下瘤（5.33±1.15 vs 1.33±0.58，P<0.01）（图3e），提示敲低KIF15抑制了Hep3B皮下瘤的增殖能力，而增强了凋亡水平。综上，敲低KIF15能够抑制HCC的体内生长能力。

注： a，造模后皮下瘤瘤体照片；b，瘤体的体积；c，瘤体的重量；d、e，免疫组化染色分析Hep3B（sh-NC/sh3）瘤体组织中Ki67和TUNEL表达情况。

图  3  KIF15对HCC体内生长能力的影响

Figure  3.  Effect of KIF15 on the growth capacity of hepatocellular carcinoma in vivo

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2.4   KIF15对HCC增殖能力影响的机制

通过GSEA分析KIF15在HCC中发挥作用的潜在机制，发现KIF15与PI3K/AKT/mTOR通路呈正相关（NES=1.59，P<0.001）（图4a）。Western Blot实验结果表明，与sh-NC-Hep3B细胞相比，sh3-Hep3B细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路受到显著抑制（P值均<0.001）（图4b，表3）；而与vector组相比，过表达KIF15能够促进HepG2细胞的PI3K/AKT/mTOR信号通路显著增强（P值均<0.001）（图4c，表4）；此外，PI3K抑制剂LY294002能够抑制LV-KIF15-HepG2细胞中的PI3K/AKT/mTOR信号通路（图4d，表5）。CCK-8实验结果表明，当LY294002抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路后，LY294002+LV-KIF15-HepG2细胞的活力较LV-KIF15-HepG2细胞明显下降（1.084±0.118 vs 1.670±0.102，P<0.01）（图4e）。平板克隆实验结果显示，相较于LV-KIF15-HepG2细胞，LY294002处理后的LV-KIF15-HepG2细胞的克隆形成能力受到显著抑制（78.33±7.64 vs 161.67±17.56，P<0.01）（图4f）。EdU染色实验显示，相较于LV-KIF15-HepG2细胞，LY294002处理后的LV-KIF15-HepG2细胞的EdU阳性率显著降低［（18.61±1.24）% vs （28.54±3.83）%，P<0.05］（图4g）。综上，KIF15通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进HCC的增殖能力。

注： a，GSEA分析KIF15在HCC中潜在的作用通路；b，Western Blot验证Hep3B细胞中PI3K/AKT/mTOR通路表达情况；c、d，Western Blot验证HepG2细胞中PI3K/AKT/mTOR通路表达情况；e，CCK-8实验分析HepG2细胞增殖活力；f，克隆形成实验分析HepG2细胞克隆数；g，EdU实验分析HepG2细胞增殖活力。

图  4  KIF15对HCC增殖能力影响的机制探究

Figure  4.  The mechanism of the effect of KIF15 on the proliferation of hepatocellular carcinoma

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表  3  Western Blot 检测Hep3B细胞中相关蛋白表达结果

Table  3.  Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in Hep3B cells

分组	KIF15	p-PI3K/PI3K	p-AKT/AKT	p-mTOR/mTOR
sh-NC	1.05±0.10	0.99±0.06	0.99±0.06	0.98±0.07
sh3	0.19±0.03	0.14±0.04	0.24±0.05	0.22±0.02
t值	13.88	19.66	16.71	17.48
P值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

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表  4  Western Blot 检测HepG2细胞中相关蛋白表达结果

Table  4.  Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in HepG2 cells

分组	KIF15	p-PI3K/PI3K	p-AKT/AKT	p-mTOR/mTOR
vector	1.00±0.06	1.04±0.10	1.02±0.06	0.96±0.04
KIF15	6.12±0.20	5.11±0.22	4.56±0.49	4.56±0.55
t值	41.97	29.29	12.46	11.24
P值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001

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表  5  LY294002抑制剂干预对HepG2细胞中相关蛋白表达的影响

Table  5.  The effect of inhibitor LY294002 intervention on the expression of related proteins in HepG2 cells

分组	KIF15	p-PI3K/PI3K	p-AKT/AKT	p-mTOR/mTOR
vector	1.06±0.13	1.01±0.09	0.96±0.08	0.97±0.05
KIF15	5.68±0.35	4.64±0.57	4.70±0.51	4.82±0.37
KIF15+LY294002	5.42±0.251）	1.17±0.091）	1.07±0.121）	1.22±0.101）
F值	301.05	111.64	145.32	284.41
P值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
注：与KIF15组比较，1）P<0.05。

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3.   讨论

肝癌发病率和死亡率位列全球恶性肿瘤第6位和第4位，预计到2040年全球将有140万肝癌患者，且将有130万人死于肝癌^［8］。目前HCC的主要治疗方法是手术、介入、化疗和免疫治疗等，但是患者的复发率仍然较高，5年生存率仅约20%^［9-11］。因此，探究HCC发生和发展的机制，对HCC的诊治将提供重要的理论基础。

KIF15，又名kinesin-12，是一种微管相关蛋白，其功能是微管依赖转运或纺锤体组织的调节因子^［12-13］。已有大量研究^［14-15］揭示了KIF15在多种肿瘤中的作用。在胰腺癌中，KIF15通过招募USP10和磷酸甘油酸激酶1增强胰腺癌细胞的糖酵解能力，从而增强其恶性程度^［16］；敲低KIF15后，胶质瘤的增殖能力受到抑制^［17］；此外，KIF15在鼻咽癌组织中高表达，与鼻咽癌预后不良相关，敲低KIF15将抑制鼻咽癌细胞株的增殖和倾袭能力^［18］。在前列腺癌中，KIF15通过增强前列腺癌细胞的雄激素受体（AR）信号通路来促进恩杂鲁胺耐药；机制上，KIF15直接结合AR/AR-v7的N端，通过增加USP14与AR/AR-v7的蛋白结合，阻止AR/AR-v7蛋白的降解^［19］。HCC作为恶性程度较高的常见肿瘤，KIF15对HCC的作用尚不明确。

本研究通过分析TCGA和GEPIA数据库发现KIF15在HCC组织中表达显著增高，且KIF15高表达与HCC不良预后相关。通过qRT-PCR和Western Blot评估KIF15在HCC细胞株中的表达水平，选择HepG2过表达KIF15以及选择Hep3B敲低KIF15，验证过表达和敲低的效率后进行细胞实验的探究。结果显示，过表达KIF15导致HCC细胞株的增殖能力增强，而敲低KIF15能够抑制HCC细胞株的增殖；并且敲低KIF15能够抑制HCC的体内生长能力。上述结果表明KIF15在HCC中发挥促进增殖的促癌作用。

已有大量研究^［20-22］报道，PI3K/AKT/mTOR信号通路在癌症进展中发挥关键作用。TBK1通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进甲状腺癌进展^［23］；UHMK1通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肺腺癌的发生^［24］；STK3通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，降低胰腺癌细胞的增殖能力，并且促进癌细胞的凋亡^［25］。本研究通过GSEA分析发现KIF15在HCC中与PI3K/AKT/mTOR的激活呈正相关。通过Western Blot分析发现，过表达KIF15能够激活HepG2细胞的PI3K/AKT/mTOR通路，而敲低KIF15导致Hep3B细胞的PI3K/AKT/mTOR通路受到抑制。通过进一步实验发现，PI3K抑制剂LY294002能够抑制过表达KIF15的HepG2细胞中的PI3K/AKT/mTOR通路，并且导致细胞的增殖能力受到显著抑制。

综上所述，本研究证实KIF15通过激活PI3K/AKT/mTOR通路，发挥促进HCC的增殖能力，为KIF15作为肝癌的诊断标志和预后指标提供了理论依据，但是KIF15在HCC中的精确机制仍需深入探究。