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舒肝和络醒脾方对肝纤维化模型大鼠肝组织Wnt/β-Catenin信号通路的影响

王奎淞 张秋菊 魏书瑶 殷世鹏 李婕妠 陈世玉 郭嘉琪 赵鲲鹏

引用本文:
Citation:

舒肝和络醒脾方对肝纤维化模型大鼠肝组织Wnt/β-Catenin信号通路的影响

DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.10.013
基金项目: 

国家自然科学基金 (81660772)

甘肃省高等学校创新基金项目 (2020A-074)

甘肃中医药大学科研创新基金 (2018-03)

伦理学声明:本研究方案于2019年3月8日经由甘肃中医药大学实验动物伦理委员会审批,批号:2019-140,符合实验室动物管理与使用准则。
利益冲突声明:本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突。
作者贡献声明:王奎淞负责课题设计,资料分析,撰写论文;魏书瑶、殷世鹏、李婕妠、陈世玉、郭嘉琪参与收集数据,修改论文;赵鲲鹏、张秋菊负责拟定写作思路,指导撰写文章并最后定稿。
详细信息
    通信作者:

    赵鲲鹏, 896100698@qq.com

Shugan Heluo Xingpi Decoction inhibits liver fibrosis through regulation of Wnt/β-Catenin signaling pathway

Research funding: 

National Natural Science Foundation of China (81660772);

Innovation Fund Project of Gansu Higher Education Institutions (2020A-074);

Scientific Research Innovation Fund of Gansu University of Traditional Chinese Medicine (2018-03)

More Information
    Corresponding author: ZHAO Kunpeng, 896100698@qq.com(ORCID: 0000-0003-0556-1600)
  • 摘要:   目的  观察舒肝和络醒脾方对CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠的治疗作用,并基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨其作用机制。  方法  将60只雄性SPF级Wistar大鼠随机分为空白对照组,模型组,阳性对照组,舒肝和络醒脾方高、中、低剂量组,每组10只,模型和用药大鼠给予腹腔注射40% CCl4油溶液诱导肝纤维化模型。空白对照组和模型组给予10 mL/kg生理盐水灌胃,阳性对照组用水飞蓟宾葡甲胺溶液50 mg/kg灌胃,舒肝和络醒脾方高、中、低剂量组分别按12.42 g/kg、6.21 g/kg和3.11 g/kg(生药/体质量)灌胃,每日1次,持续8周。给药8周后处死,期间动态监测各组大鼠的生理状况。处死后取血清于碱水解比色法检测羟脯氨酸,于全自动生化分析仪检测AST、ALT、总蛋白和Alb水平;HE染色及Masson染色观察肝脏的病理学形态改变;RT-qPCR法、Western Blot法检测Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的mRNA和蛋白水平的表达。计量资料多组间比较采用one-way ANOVA分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。  结果  与模型组比较,飞蓟宾葡甲胺溶液和舒肝和络醒脾方用药干预后的大鼠生理状况改善明显;血液学指标方面,与模型组比较,阳性对照组和舒肝和络醒脾方干预后大鼠血清中HYP、ALT、AST和Glo水平显著降低(P值均<0.05),总蛋白、Alb和A/G水平明显升高(P值均<0.05);与阳性对照组比较,舒肝和络醒脾方低剂量组的ALT、AST水平显著升高(P值均<0.05),总蛋白、Alb和A/G水平明显降低(P值均<0.05);肝组织学方面,HE染色显示阳性对照组可见门静脉轻度纤维化伴少量纤维间隔,肝细胞轻微脂肪变;舒肝和络醒脾方低剂量组可见明显门静脉纤维化伴少量纤维间隔;舒肝和络醒脾方中剂量组可见少量门静脉轻微纤维化;舒肝和络醒脾方高剂量组未观察到明显异常。Masson染色显示,舒肝和洛醒脾方高剂量组在胶原沉积的治疗效果方面优于水飞蓟宾葡甲胺组和舒肝和络醒脾方中、低剂量组(P值均<0.05),与舒肝和络醒脾方高剂量组基本等效。水飞蓟宾葡甲胺和舒肝和络醒脾方高、中剂量干预对Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的mRNA水平和蛋白表达的抑制作用更明显(P值均<0.05)。  结论  舒肝和络醒脾方能够发挥稳定的抗肝纤维化作用,高剂量作用效果较为显著,调节Wnt/β-Catenin信号通路可能为其抗肝纤维化的信号途径之一。

     

  • 图  1  肝组织HE染色结果(×400)

    注:a, 正常对照组;b, 模型组;c, 阳性对照组;d, 舒肝和络醒脾方高剂量组;e, 舒肝和络醒脾方中剂量组;f, 舒肝和络醒脾方低剂量组。

    Figure  1.  HE staining of liver sections(×400)

    图  2  肝组织Masson染色结果(×400)

    注:a, 正常对照组;b, 模型组;c, 阳性对照组;d, 舒肝和络醒脾方高剂量组;e, 舒肝和络醒脾方中剂量组;f, 舒肝和络醒脾方低剂量组。

    Figure  2.  Masson staining of liver sections(×400)

    图  3  各组大鼠肝组织中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的蛋白表达

    注:空白,空白对照组;模型,模型组;阳性,阳性对照组;高,舒肝和络醒脾方高剂量组;中,舒肝和络醒脾方中剂量组;低,舒肝和络醒脾方低剂量组。

    Figure  3.  Protein expression of Wnt1, β-Catenin, and Cyclin D1 in liver tissues of rats in each group

    表  1  慢性肝炎分级和肝纤维化分期标准

    Table  1.   Criteria for grading of chronic hepatitis and staging of liver fibrosis

    分期 评分 病理描述
    S0 G0 无纤维化改变
    S1 G1 轻微,门静脉扩张伴门脉区局限性纤维化
    S2 G2 轻度,门静脉纤维化伴少量纤维间隔
    S3 G3 中度,门脉纤维变性伴大量纤维间隔(假小叶)
    S4 G4 重度(肝硬化),明显门静脉-门静脉和门静脉-中央型纤维化伴有再生结节,形成假小叶
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    表  2  PCR引物列表

    Table  2.   Primer sequences used in RT-PCR

    引物名称 上游(5′-3′) 下游(5′-3′) 产物大小(kb)
    Wnt1 GGGTTTCTGCTACGTTGCTACTGG AGGTTCGTGGAGGAGGCTATGTTC 742
    β-Catenin TGGCTATTACGACAGACTGCC ACAGACAGCACCTTCAGCACT 1170
    Cyclin D1 GGGCGGATAGAGTTGTCAGTGTAG TTACTTCAAGTGCGTGCAGAGG 1664
    β-actin CCCATCTATGAGGGTTACGC TTTAATGTCACGCACGATTTC 150
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    表  3  各组HYP、ALT、AST表达水平比较

    Table  3.   Expression levels of HYP, ALT and AST in each group

    组别 动物数(只) HYP(μg/L) ALT(U/L) AST(U/L)
    空白对照组 10 226.23±21.83 52.85±7.67 144.78±10.96
    模型组 6 465.11±52.041) 153.67±20.841) 476.56±39.801)
    阳性对照组 9 335.19±212.062) 62.51±6.172) 242.34±41.512)
    舒肝和络醒脾方高剂量组 9 309.72±5.092) 54.53±8.512) 185.12±24.242)
    舒肝和络醒脾方中剂量组 8 341.19±10.092) 59.27±7.582) 200.83±29.842)
    舒肝和络醒脾方低剂量组 7 360.22±9.602) 109.19±12.682)3) 348.85±30.812)3)
    注: 与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型组相比较,2)P<0.05;与阳性对照组相比较,3)P<0.05。
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    表  4  各组TP、Alb、Glo和A/G表达水平比较

    Table  4.   Expression levels of TP, Alb, Glo and A/G in each group

    组别 动物数(只) TP(g/L) Alb(g/L) Glo(g/L) A/G
    空白对照组 10 76.60±4.37 36.24±2.12 36.76±2.56 0.99±0.12
    模型组 6 61.10±4.091) 18.56±1.331) 44.14±1.531) 0.42±0.041)
    阳性对照组 9 69.56±1.482) 31.97±1.772) 36.79±1.682) 0.87±0.092)
    舒肝和络醒脾方高剂量组 9 69.61±1.752) 32.56±1.922) 37.05±1.282) 0.88±0.072)
    舒肝和络醒脾方中剂量组 8 67.83±1.062) 29.42±1.612) 38.41±1.862) 0.77±0.072)
    舒肝和络醒脾方低剂量组 7 60.96±1.153) 26.60±0.522)3) 38.56±0.912) 0.69±0.033)
    注: 与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型组相比较,2)P<0.05;与阳性对照组相比较,3)P<0.05。
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    表  5  各组HE染色切片分级及评分

    Table  5.   HE stained section grading and scoring

    组别 动物数(只) 分期 评分
    空白对照组 10 S0 G0
    模型组 6 S3 G3
    阳性对照组 9 S2 G2
    舒肝和络醒脾方高剂量组 9 S1 G1
    舒肝和络醒脾方中剂量组 8 S2 G2
    舒肝和络醒脾方低剂量组 7 S3 G3
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    表  6  各组Masson染色切片肝纤维化分级及胶原容积分数半定量分析结果

    Table  6.   Semi-quantitative analysis results of liver fibrosis grade and collagen volume fraction of Masson stained sections in each group

    组别 动物数(只) 分期 胶原容积分数(%)
    空白对照组 10 S0 0.91±0.55
    模型组 6 S3 85.11±15.821)
    阳性对照组 9 S2 36.56±10.842)
    舒肝和络醒脾方高剂量组 9 S1 8.13±1.802)3)
    舒肝和络醒脾方中剂量组 8 S2 22.21±7.122)
    舒肝和络醒脾方低剂量组 7 S3 56.22±8.452)
    注: 与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型组相比较,2)P<0.05;与阳性对照组相比较,3)P<0.05。
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    表  7  各组大鼠肝组织中Wnt1、β-Catenin和CyclinD1 mRNA的表达

    Table  7.   Wnt1, β-Catenin, Cyclin D1 mRNA expression in liver tissues of rats in each group

    组别 动物数(只) Wnt1 β-Catenin Cyclin D1
    空白对照组 10 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
    模型组 6 2.74±1.001) 2.57±0.941) 2.72±0.771)
    阳性对照组 9 0.97±0.102) 0.77±0.102) 0.86±0.152)
    舒肝和络醒脾方高剂量组 9 0.84±0.272) 0.70±0.272) 0.66±0.222)
    舒肝和络醒脾方中剂量组 8 0.67±0.142) 0.81±0.212) 0.54±0.122)
    舒肝和络醒脾方低剂量组 7 1.03±0.272) 1.01±0.252) 1.13±0.302)
    注: 与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型组相比较,2)P<0.05;与阳性对照组相比较,3)P<0.05。
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    表  8  各组大鼠组织Wnt1、β-Catenin和CyclinD1蛋白表达水平比较

    Table  8.   Comparison of Wnt1, β-Catenin and Cyclin D1 protein expression in rat tissues of each group

    组别 动物数(只) Wnt1 β-Catenin Cyclin D1
    空白对照组 10 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
    模型组 6 1.74±0.131) 1.81±0.291) 1.43±0.271)
    阳性对照组 9 1.06±0.162) 0.72±0.142) 1.02±0.042)
    舒肝和络醒脾方高剂量组 9 0.84±0.092) 0.70±0.112) 0.78±0.102)
    舒肝和络醒脾方中剂量组 8 0.83±0.032) 1.25±0.112)3) 0.92±0.112)
    舒肝和络醒脾方低剂量组 7 1.39±0.45 1.58±0.133) 1.12±0.17
    注: 与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型组相比较,2)P<0.05;与阳性对照组相比较,3)P<0.05。
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-03-25
  • 录用日期:  2022-05-19
  • 出版日期:  2022-10-20
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