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ISSN 1001-5256
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过表达HBx的肝细胞对肝星状细胞增殖和活化的影响及其机制

任婷玉 聂赫中容 肖利佳 林芳楠 王大明 宋春丽 周义文

任婷玉,聂赫中容, 肖利佳,等. 过表达HBx的肝细胞对肝星状细胞增殖和活化的影响及其机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2021, 37(7): 1561-1566. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.07.017
引用本文: 任婷玉,聂赫中容, 肖利佳,等. 过表达HBx的肝细胞对肝星状细胞增殖和活化的影响及其机制[J]. 临床肝胆病杂志, 2021, 37(7): 1561-1566. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.07.017
REN TY, NIE HZR, XIAO LJ, et al. Effect of hepatitis B x gene-overexpressed hepatocytes on the proliferation and activation of hepatic stellate cells and related mechanism[J]. J Clin Hepatol, 2021, 37(7): 1561-1566. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.07.017
Citation: REN TY, NIE HZR, XIAO LJ, et al. Effect of hepatitis B x gene-overexpressed hepatocytes on the proliferation and activation of hepatic stellate cells and related mechanism[J]. J Clin Hepatol, 2021, 37(7): 1561-1566. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.07.017

过表达HBx的肝细胞对肝星状细胞增殖和活化的影响及其机制

DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.07.017
基金项目: 

国家自然科学基金面上项目 81974457

国家自然科学青年基金项目 81702088

广东省自然科学基金项目 2018A030313740

广东省自然科学基金项目 2018A030310446

广东省自然科学基金项目 2019A1515012079

广东省医学科学技术研究基金项目 B2018013

南方医科大学深圳医院苗苗计划项目 2018MM02

深圳市宝安区科技计划基础研究项目 2019JD443

详细信息
    通讯作者:

    周义文,yiwenzhou21@aliyun.com

  • 中图分类号: R512.6;R575.2

Effect of hepatitis B x gene-overexpressed hepatocytes on the proliferation and activation of hepatic stellate cells and related mechanism

Funds: 

National Natural Science Foundation of China 81974457

National Natural Science Foundation of China 81702088

Natural Science Foundation of Guangdong Province 2018A030313740

Natural Science Foundation of Guangdong Province 2018A030310446

Natural Science Foundation of Guangdong Province 2019A1515012079

Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province B2018013

Seeding Program of Shenzhen Hospital of Southern Medical University 2018MM02

Research Fund of Innovation and Technology Bureau of Baoan District 2019JD443

  • 摘要:   目的  探讨HBV感染对肝星状细胞(HSC)活化的影响及作用机制。  方法  收集2020年11月—2021年1月慢性乙型肝炎患者血浆30份、乙型肝炎肝硬化患者血浆42份、肝细胞癌患者血浆30份及健康体检者(健康对照组)的血浆18份,ELISA法检测血浆和条件培养液中HBx、TGFβ1、多巴胺β羟化酶(DBH)和羟脯氨酸(Hyp)的含量。采用LO2细胞构建过表达HBx稳转株细胞, LO2细胞分为LO2-HBx组(稳定表达HBx)、阴性对照组(LO2-con)、空白组,分别制备LO2-HBx、LO2-con和LO2细胞(Mock)的条件培养基,孵育人HSC株LX-2,分为LX-2/LO2-HBx、LX-2/LO2-con、LX-2/Mock 3组,采用CCK-8法检测各组细胞增殖变化。采用rhTGFβ1刺激LX-2细胞,另采用TGFβ1受体抑制剂处理LX-2/LO2-HBx组细胞。荧光定量PCR或Western Blot法检测LO2细胞中的HBx及上述LX-2细胞中α-SMA、Col1A1、DBH和TGFβ1的表达。多组间比较采用单因素方差分析,进一步比较方法采用Bonferroni法;2组间比较采用t检验;相关性分析采用Pearson法。  结果  LO2-HBx可稳定表达HBx蛋白,其培养上清中TGFβ1含量升高(F=324.701,P<0.01);共培养LX-2/LO2-HBx组细胞发生明显细胞形态变化,出现细胞收缩,胞突明显伸长,胞内脂滴减少,与LX-2/LO2-con组比较其增殖活力明显增强(P<0.05),且α-SMA和Col1A1的mRNA(F值分别为144.712和76.680,P值均<0.01)及蛋白(F值分别为234.142和528.708,P值均<0.001)表达水平升高;LX-2/LO2-HBx组细胞中TGFβ1 mRNA(F=29.382, P<0.01)及DBH mRNA水平升高(F=42.662, P<0.01)。随着rhTGFβ1刺激浓度的增加,LX-2细胞中α-SMA(F=1 794.031,P<0.01)、Col1A1(F=91.340,P<0.01)及DBH(F=2 501.011,P<0.01)表达增加,在rhTGFβ1 10 ng/ml时达到峰值。在LO2-HBx组条件培养液中加入TGFβ1受体抑制剂后LX-2细胞中DBH和Col1A1的表达较对照组下调(t值分别为3.603、5.798,P值均<0.05)。慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、肝细胞癌患者的血浆TGFβ1(F=51.188,P<0.001)、HBx(F=39.227,P<0.001)、DBH(F=34.431,P<0.001)及Hyp(F=16.211,P<0.001)较健康对照组升高,血浆中HBx与TGFβ1、TGFβ1与DBH、Hyp与DBH的表达量呈正相关,r分别为0.931、0.863、0.765(P值均<0.001)。  结论  HBx蛋白可促进LO2细胞分泌TGFβ1,诱导LX-2的增殖和活化,促进肝纤维化的发生,并上调LX-2细胞中TGFβ1及DBH的表达;rhTGFβ1刺激可诱导LX-2活化和DBH表达上调。

     

  • 图  1  Western Blot检测3组LO2肝细胞系中HBx蛋白的表达量

    图  2  3组条件培养基培养的LX-2细胞培养48 h后形态及α-SMA和Col1A1表达变化

    注:a,LX-2细胞形态变化;b,α-SMA和Col1A1mRNA表达变化;c,α-SMA和Col1A1蛋白表达变化。

    图  3  CCK-8检测3组条件培养基培养的LX-2细胞的增殖活力

    注:与LX-2/LO2-con组比较,*P<0.05。

    图  4  条件培养基中TGFβ1的含量及条件培养后LX-2细胞中TGFβ1及DBH表达变化

    注:a,3组条件培养液中TGFβ1含量检测;b、c,条件培养液培养后LX-2细胞中TGFβ1及DBH mRNA表达变化。

    图  5  加入TGFβ1受体抑制剂处理后LX-2/LO2-HBx组细胞Col1A1及DBH的mRNA表达变化

    图  6  rhTGFβ1刺激LX-2细胞后α-SMA、Col1A1、DBH的mRNA表达变化

    图  7  临床样本中HBx、TGFβ1、Hyp及DBH相关性分析

    表  1  ELISA检测4组临床样本中HBx、TGFβ1、Hyp及DBH含量

    组别 例数 HBx(ng/ml) TGFβ1(pg/ml) Hyp(μmol/L) DBH(ng/ml)
    健康对照组 18 0.86±0.37 16.01±6.32 201.87±95.64 50.87±20.83
    慢性乙型肝炎组 30 26.41±9.161) 471.00±176.011) 591.53±216.401) 365.44±130.621)
    乙型肝炎肝硬化组 42 17.87±7.151)2) 500.94±157.621) 652.83±236.171) 378.66±127.131)
    肝细胞癌组 30 23.34±9.491) 513.09±163.841) 560.29±195.701) 349.00±138.531)
    F 39.227 51.188 16.211 34.431
    P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
    注: 与对照组比较,1)P<0.01, 与慢性乙型肝炎组比较,2)P<0.05。
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-02-01
  • 修回日期:  2021-03-24
  • 刊出日期:  2021-07-20
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