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利用CRISPR/Cas9慢病毒载体构建敲除大鼠肝星状细胞COX-2基因的细胞模型

彭敏 曹婷 阳学风 易世杰 傅念 周克兵 龙建武

彭敏, 曹婷, 阳学风, 等. 利用CRISPR/Cas9慢病毒载体构建敲除大鼠肝星状细胞COX-2基因的细胞模型[J]. 临床肝胆病杂志, 2021, 37(2): 336-342. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.02.018
引用本文: 彭敏, 曹婷, 阳学风, 等. 利用CRISPR/Cas9慢病毒载体构建敲除大鼠肝星状细胞COX-2基因的细胞模型[J]. 临床肝胆病杂志, 2021, 37(2): 336-342. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.02.018
PENG M, CAO T, YANG XF, et al. Application of CRISPR/Cas9 lentiviral vector in construction of rat hepatic stellate cells with COX-2 gene knockout [J]. J Clin Hepatol, 2021, 37(2): 336-342. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.02.018
Citation: PENG M, CAO T, YANG XF, et al. Application of CRISPR/Cas9 lentiviral vector in construction of rat hepatic stellate cells with COX-2 gene knockout [J]. J Clin Hepatol, 2021, 37(2): 336-342. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.02.018

利用CRISPR/Cas9慢病毒载体构建敲除大鼠肝星状细胞COX-2基因的细胞模型

DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2021.02.018
基金项目: 

国家自然科学基金 81373465

湖南省自然科学省市联合基金 2016JJ5010

湖南省卫生计生委科研课题 A2017015

湖南省卫生健康委科研立项课题 20201938

衡阳市科技局课题 2015KJ63

详细信息
    作者简介:

    彭敏(1990—),女,主要从事脂肪肝及肝硬化基础与临床方面的研究

    通讯作者:

    曹婷,396406846@qq.com

  • 利益冲突声明:本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突,特此声明。
  • 作者贡献声明:彭敏、曹婷、阳学风负责课题设计,资料分析,撰写论文;易世杰、周克兵、龙建武参与收集数据,修改论文;傅念、阳学风负责拟定写作思路,指导撰写文章并最后定稿。
  • 中图分类号: R575.2

Application of CRISPR/Cas9 lentiviral vector in construction of rat hepatic stellate cells with COX-2 gene knockout

  • 摘要:   目的  通过构建CRISPR/Cas9慢病毒载体,转染HSC-T6细胞,获得能稳定表达Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞,为后期的功能研究提供良好的工具和手段,为临床上治疗肝纤维化提供新策略。  方法  设计合成COX-2基因特异性的sgRNA(COX-2-sgRNA-1、COX-2-sgRNA-2、COX-2-sgRNA-3),并将其连接至GV371载体上,提取重组后的质粒,将其与包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度。按照MOI值计算病毒最适用量,先将Lenti-Cas9-puro转染至HSC-T6细胞,嘌呤霉素筛选得到HSC-T6-Cas9细胞,再用Lenti-COX-2-sgRNA-EGFP转染至HSC-T6-Cas9细胞获得HSC-T6-COX-2-/-细胞,通过Cruiser酶切检测及Western Blot等方法在基因和蛋白水平上进行敲除验证。计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。  结果  通过测序验证COX-2-sgRNA表达载体构建成功。重组表达质粒和包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度均在1×108以上。成功构建能稳定传代的Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞模型。HSC-T6-Cas9细胞中LV-Cas9-Puro mRNA相对表达量(541.93±105.76)高于CON组细胞(1.00±0.02),差异具有统计学意义(t=12.995,P<0.01)。通过Cruiser酶切检测及Western Blot试验,结果提示CRISPR/Cas9慢病毒表达载体能在靶点起作用,其中COX-2-sgRNA-2敲除作用最明显,并且COX-2蛋白表达水平较CON组和NC组相比显著下降(P值均<0.05),提示COX-2-sgRNA有活性。  结论  成功构建了针对COX-2靶基因的CRISPR/Cas9慢病毒载体,获得稳定的COX-2基因敲除的HSC-T6-COX-2-/-细胞。
  • 图  1  sgRNA表达载体阳性克隆转化子测序峰图

    注:a,COX-2-sgRNA-1; b, COX-2-sgRNA-2;c,COX-2-sgRNA-3。

    图  2  不同稀释倍数COX-2-sgRNA慢病毒感染293T细胞的荧光表达情况(×100)

    图  3  puromycin筛选前后HSC-T6-Cas9细胞状态(×100)

    注:左右分别是同一视野下光学显微镜图片和荧光显微镜图片。a,CON组;b,puromycin筛选前HSC-T6-Cas9细胞;c,puromycin筛选后HSC-T6-Cas9细胞。

    图  4  扩增曲线

    图  5  熔解曲线

    图  6  HSC-T6-Cas9细胞冻存后复检图片(×100)

    注:左右分别是同一视野下光学显微镜图片和荧光显微镜图片。

    图  7  72 h慢病毒转染HSC-T6细胞图片(×200)

    注:左右分别是同一视野下光学显微镜图和荧光显微镜图。a,CON组; b,KO1组; c,KO2组; d,KO3组; e,NC组。

    图  8  PCR产物检测图

    注:a,酶切前;b,Cruiser酶切后。

    图  9  注:1, CON组;2, NC组;3,KO组。

    转染72 h各组细胞COX-2蛋白表达水平

    图  10  转染96 h各组细胞中COX-2蛋白表达水平

    注:1,CON组; 2,NC组; 3,KO组。

    表  1  LV-Cas9-Puro基因的引物序列

    基因 引物序列(5′-3′) 扩增片段大小(bp)
    LV-Cas9-Puro 上游GCTGAAAACCTATGCCCACC 133
    下游GATTGTCTTGCCGGACTGCT
    GAPDH 上游TTCAACGGCACAGTCAAGG 114
    下游CTCAGCACCAGCATCACC
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    表  2  PCR引物序列

    引物名称 引物序列(5′-3′)
    COX-2-E1-SVF AGTGACTGACAGGCTGTCTTGTC
    COX-2-E1-SVR CACAATGTTCCAGACTCCCTTG
    COX-2-E2-SVF GTGAAAACTGTACTACGCGTAAG
    COX-2-E2-SVR CTTCAAGGCGTTTTGAAAAGGTC
    COX-2-E3-SVF AGTGACTGACAGGCTGTCTTGTC
    COX-2-E3-SVR CACAATGTTCCAGACTCCCTTG
    下载: 导出CSV

    表  3  转染72 h、96 h各组COX-2蛋白质相对表达情况

    组别 72 h COX-2 96 h COX-2
    CON组 0.57±0.02 1.14±0.21
    KO组 0.11±0.021) 0.09±0.031)
    NC组 0.55±0.022) 0.49±0.152)
    F 586.926 143.643
    P <0.01 <0.01
    注:与CON组比较,1)P<0.01;与KO组比较,2)P<0.01。
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-07-29
  • 修回日期:  2020-10-12
  • 刊出日期:  2021-02-20
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